Directed differentiation and purification of motor neurons from human induced pluripotent stem cells to model Amyotrophic Lateral Sclerosis
Différenciation et purification de motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines pour la modélisation de la Sclérose Latérale Amyotrophique
par Toli Diana Eleni sous la direction de Bohl Delphine
Thèse de doctorat en Neurosciences
École doctorale Génétique, Cellulaire, Immunologie, Infectiologie et Développement

Soutenue le Wednesday 27 November 2013 à Université Paris Descartes ( Paris 5 )

Sujets
  • Neurones moteurs
  • Neurosciences
  • Neurotrophines
  • Sclérose latérale amyotrophique
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Mots clés
Cellules souches pluripotentes induites, Purification de motoneurones, Sclérose Latérale Amyotrophique
Resumé
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable de l'adulte qui affecte principalement les motoneurones. Les mécanismes conduisant à la mort des motoneurones restent mal connus, notamment du fait de l'hétérogénéité de la maladie et du manque d'accès aux neurones humains affectés. La technologie des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSc) est un outil prometteur pour la modélisation de la SLA, car elle offre la possibilité unique d'obtenir et d'étudier des motoneurones humains.Des clones d'iPSc de deux sujets témoins ont été générés et nous avons comparé plusieurs protocoles afin de mettre au point un protocole efficace de différenciation des iPSc en motoneurones. Les cultures obtenues étaient hétérogènes et contenaient différents types de neurones et des précurseurs neuraux. Afin de pouvoir étudier des mécanismes intrinsèques aux motoneurones dans la SLA, nous avons développé une nouvelle technique pour purifier les motoneurones. Cette technique a consisté à trier les motoneurones par FACS en combinant l'utilisation d'un vecteur lentiviral rapporteur exprimant une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur spécifique des motoneurones, et d'un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur aux neurotrophines p75. Cette double sélection a permis l'isolement efficace de motoneurones purs. En parallèle, la technologie iPSc a été utilisée pour établir des modèles cellulaires de la SLA. Des clones de cellules iPS ont été générés à partir d'un patient avec une forme familiale de la SLA présentant une mutation dans le gène TARDBP (codant pour une protéine de liaison à l'ADN, TDP-43) et un patient atteint d'une forme sporadique de SLA. Afin de valider nos modèles, nous avons recherché des phénotypes caractéristiques de la maladie au cours de la différenciation des iPSc : i) la formation d'agrégats cytoplasmiques, ii) des altérations de génération et de survie des motoneurones, iii) des défauts de croissance neuritique.