Chemical biology approaches to study toxin clustering and lipids reorganization in Shiga toxin endocytosis
Etude de la condensation et de la réorganisation des lipides lors de l'endocytose de la toxine de Shiga via une approche de biologie chimique
par Gao Haifei sous la direction de Florent Jean-Claude et de Johannes Ludger
Thèse de doctorat en Biochimie
École doctorale Médicament, Toxicologie, Chimie, Imageries

Soutenue le Thursday 12 November 2015 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • Cellules -- Agrégation
  • Endocytose
  • Glycosphingolipides
  • Lipides -- Métabolisme
  • Lipides des membranes
  • Produits de condensation (chimie)
  • Vérotoxines
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Mots clés
Toxine de Shiga, STxB, Glycosphingolipides, Gb3, Voie d'endocytose indépendante de la clathrine, Aggrégation de la toxine, Lipides réorganisation, Condensation lipidique, Fluctuation membranaire, Force de Casimir, Flexion membranaire, Spectroscopie de corrélation de fluorescence, Réflectivité de rayons X, Diffraction des rayons X par incidence rasante, GSL reconstitution, Chimie clic sans cuivre, Gb3 fluorescent
Resumé
La toxine bactérienne de Shiga se lie au glycosphingolipide (GSL) globotriaosylcéramide (Gb3) afin d'entrer par endocytose dans les cellules en utilisant une voie dépendante et indépendante de la clathrine. Dans la voie indépendante de la clathrine, la toxine de Shiga réorganise les lipides de la membrane de façon à imposer une contrainte mécanique sur la bicouche, conduisant ainsi à la formation de pic d'invagination d'endocytose profonds et étroits. Mécaniquement ce phénomène n'est pas encore compris, notamment il reste énigmatique, comment se traduisent les propriétés géométriques de l'agrégation des glycosphingolipides GSLS et de la toxine. Dans mon travail de thèse, via l'utilisation de la sous-unité B de la toxine de Shiga (STxB) comme un modèle, différentes espèces moléculaires de son récepteur Gb3 ont été synthétisés avec des structures délibérément choisis. Les études réalisées par imagerie de haute résolution et par la modélisation informatique ont permis d'élucider les contraintes mécano-chimique sous-jacente conduisant à une réorganisation efficace qui a pour résultat l'agrégation de la toxine et la réorganisation des lipides. En combinant des expériences de simulation sur ordinateur de dynamique des particules dissipatives (DPD) et des expériences sur des modèles de membranes cellulaires, nous avons fourni la preuve de l'induction d'une force de fluctuation-membrane, de type « force de Casimir », conduisant à l'agrégation des molécules de toxines associées à la membrane à des échelles de longueur mésoscoiques. Nous avons observé et mesuré, en outre la condensation lipidique induite par la toxine, quantitativement sur des monocouches de Langmuir en utilisant la réflectivité des rayons X (XR) et par la mesure de la diffraction des rayons X par incidence rasante (GIXD), fournissant ainsi une preuve directe de l'hypothèse que la toxine a le potentiel de réduire de façon asymétrique la surface moléculaire sur la partie membranaire exoplasmique, ce qui conduit à une déformation locale de la membrane. Durant ma thèse, nos efforts ont été consacrés à la réalisation de nouveaux glycosphinolipides (GSL) comme outils chimiques à visée biologique. Par ailleurs, une nouvelle stratégie de reconstitution de GSL fonctionnels sur la membrane cellulaire, basée sur une réaction de ligation de type « click » entre un glycosyl-cyclooctyne et un azido-sphingosine a été étudiée. Les résultats obtenus sur les cellules se sont avérés beaucoup moins efficace que ceux in vitro. Une poursuite de l'optimisation de cette méthodologie est actuellement en cours. Une sonde fluorescente du glycosphinolipide Gb3, marquée à l'Alexa Fluor 568 lui-même lié par l'intermédiaire d'un bras PEG-α à la position de la chaîne acyle, a été synthétisée. Cette sonde se lie à la STxB sur couche mince de TLC, mais pas sur des membranes modèles. D'autres améliorations sont discutées.