Étude des propriétés physiques et mécaniques de microsphères d'alginate au cours d'un cycle de congélation-décongélation et application pour la cryoconservation de cellules souches mésenchymateuses encapsulées
Study of physical and mechanical properties of alginate microspheres during a freeze-thaw cycle and its application for the cryopreservation of encapsulated mesenchymal stem cells
par Hayer Benoît d' sous la direction de Mignet Nathalie
Thèse de doctorat en Biothérapie
École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries

Soutenue le Tuesday 22 May 2018 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • Alginates
  • Cellules stromales mésenchymateuses
  • Chitosane
  • Cryoconservation
  • Médecine régénératrice
  • Thérapeutique cellulaire
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Mots clés
Médecine régénérative, Thérapie cellulaire, Cellules souches mésenchymateuses, Cryoconservation, Agents cryoprotectants, Microsphères, Alginates, Chitosane
Resumé
La thérapie cellulaire et les médicaments de thérapie innovante sont des solutions prometteuses pour la régénération des tissus ou organes présentant des défauts fonctionnels ou organiques. Avant le stade de l'insuffisance cardiaque terminale (stade IV NYHA) suite à un infarctus du myocarde, l'implantation d'un patch de fibrine cellularisé avec des progéniteurs myocardiques sur le site de nécrose de l'infarctus, est l'une des perspectives qui permettrait de régénérer un muscle cardiaque fonctionnel et apparait comme étant une alternative nouvelle avec notamment un essai clinique de phase I en cours (ESCORT : NCT02057900). Cependant, cette thérapie innovante présente de réelles contraintes, parmi lesquelles, un protocole nécessitant, i) une utilisation pour la production de cellules progénitrices myocardiques CD15+, de DMSO, de sérum foetal bovin, de trypsine porcine, de fibroblastes murins pouvant être la source d'une contamination chimique ou microbiologique, ii) une caractérisation importante des cellules produites, pour déterminer leur viabilité, leur pureté, leur état de différenciation, iii) d'implanter le patch de fibrine cellularisé dans un délai limité avant l'obtention des résultats de stérilité et d'endotoxines, iv) d'inciser le péricarde et de former une poche, geste chirurgical très invasif, afin d'implanter le patch cellularisé. Avec l'objectif de limiter ces contraintes et de renforcer la sécurisation pharmaceutique de ce médicament de thérapie innovante, les différents axes de ce travail ont porté sur i) l'ajout, juste avant l'implantation, d'une étape de cryoconservation des cellules dans un milieu sans sérum et sans DMSO, mais avec des agents cryoprotectants de qualité pharmaceutique. L'avantage apporté par la cryoconservation étant de rendre possible une production par lot, et la réalisation des contrôles sans contrainte de temps avant l'implantation, ii) la vectorisation des cellules par une encapsulation dans des microsphères formant une suspension injectable et permettant une implantation directement au travers du péricarde et immédiatement après la décongélation, iii) l'utilisation de polymères bioadhésifs afin de maintenir les microsphères au site d'implantation. Dans un premier temps, ce travail a permis d'identifier l'alginate de sodium de faible viscosité à 1,2% comme polymère pour réaliser l'encapsulation à l'aide d'une buse vibrante de 120 µm de diamètre. La nature et la concentration d'agents cryoprotectants ont également été définies. Les agents cryoprotectants ont été sélectionnés parmi les oses (glucose, saccharose, tréhalose), les polyols (glycérol, mannitol, sorbitol) et l'urée, à une concentration permettant d'atteindre une osmolarité totale de 500 mOsm/L pour abaisser le point de congélation de l'eau. Enfin le chitosane de faible viscosité à 0,5% a été utilisé comme polymère bioadhésif de surface pour maintenir les propriétés mécaniques et la forme des microsphères après la congélation. Dans un second temps, une évaluation biologique a permis de mesurer l'impact des étapes du procédé d'encapsulation et de cryoconservation, sur des cellules souches mésenchymateuses humaines utilisées comme modèle. Il a ainsi été possible d'optimiser le protocole ce qui a eu pour effet d'augmenter la viabilité, évaluée après encapsulation et congélation par une analyse en cytométrie de flux avec le 7AAD, de moins de 5% à environ 35%.