| Resumé |
Les patients infectés chroniquement par le VHB ont un risque élevé de développer des maladies graves du foie telles que le carcinome hépatocellulaire. Dans les cellules infectées, le virus persiste sous la forme d'un ADN circulaire covalemment clos (ADNccc) qui reste stable même chez les patients qui suivent un traitement. La protéine virale HBc, en plus de son rôle dans la formation des capsides, est retrouvée dans le noyau et est recrutée sur l'ADNccc et modifie sa structure. Cependant son rôle dans ce contexte n'est pas encore compris. Afin de mieux comprendre le rôle nucléaire d'HBc notamment sur la biologie de l'ADNccc et l'expression des ARN viraux, nous avons construit plusieurs mutants déficients pour l'expression d'HBc. Nous avons tout d'abord construit un mutant qui possède deux codons stop après le codon 27 d'HBc suivi d'une substitution d'une partie du gène HBc par une séquence codant différents épitopes. Lors de l'infection, ce virus possède un fort défaut d'expression des ARN viraux, qui ne peut être restauré par la ré-expression d'HBc. La quantification des ARN naissants montre que le défaut semble être post-transcriptionnel mais est présent rapidement après la transcription (<2h). Ces résultats suggèrent que le défaut observé est indépendant d'HBc et que la séquence délétée de HBV HBc-Flag27* pourrait être impliquée dans un mécanisme de régulation post-transcriptionnelle. Grâce à ce virus, nous avons pu mettre en évidence que la protéine HBc apportée avec la capside lors de l'infection est capable de se réassocier sur l'ADNccc dans le noyau. Nous avons ensuite étudié des mutants ayant une séquence plus proche de la souche sauvage, sans cette substitution. Lorsqu'ils sont exprimés à partir d'un plasmide exprimant à la fois le génome et la protéine HBc sous le contrôle d'un promoteur SV40, nous observons un défaut d'expression de l'ARNpg pour des mutants possédant les codons stop après le 27e ou le 38e codon du gène HBc, mais pas lorsqu'il est placé après le 67e codon. Ces résultats suggèrent que le déplacement du codon stop d'HBc induit la diminution de l'expression de l'ARNpg et que le codon stop naturel d'HBc pourrait être protégé des voies de surveillance des ARN viraux comme la nonsense-mediated decay (NMD) qui reconnait les ARN ayant un codon stop prématuré. Lors des infections par ces virus, et donc en absence d'HBc, nous observons un défaut accru pour les virus ayant des codons stop aux codons 27 et 38 et un défaut apparait pour le virus ayant le codon stop après la position 67. Dans ce contexte, en absence d'HBc, nous avons pu voir que les ARN codants pour les protéines de surface sont également impactés et que l'expression des ARN peut être partiellement restaurée par l'expression d'HBc. Par des techniques de chromosome conformation capture nous avons pu mettre en évidence que le virus HBV HBc-27* n'est plus exclu des régions réprimées contactant des lamines, indiquant que la protéine HBc pourrait être impliquée dans la l'adressage de l'ADNccc vers des régions favorables pour la transcription. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation par HBc, nous avons isolé les partenaires nucléaires de la protéine et mis en évidence de nombreux facteurs impliqués dans la régulation de l'ADN et de la transcription ainsi que dans la réparation des dommages à l'ADN.Dans l'ensemble, nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la biologie des ARN du VHB. |