The CRISPR-Cas system of human pathogen Clostridium difficile : function and regulation
La fonction et la régulation du système CRISPR-Cas chez un pathogène humain Clostridium difficile
par Anna MAIKOVA sous la direction de Olga SOUTOURINA et de Konstantin SEVERINOV
Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité


Sujets
  • Clostridium difficile
  • Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
  • CRISPR (génétique)
  • Génome
  • Systèmes toxines-antitoxines

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Mots clés
Interférence CRISPR, Adaptation CRISPR, Système CRISPR-Cas de sous-type I-B, Régulation de CRISPR, Rédaction du génome
Resumé
Clostridium difficile (nouveau nom Clostridioides difficile) est une bactérie à Gram-positif, sporulante, anaérobie stricte, présente dans le sol et les environnements aquatiques, ainsi que dans le tractus intestinal des mammifères. C. difficile est l'un des principaux clostridies pathogènes. Cette bactérie est devenue un vrai problème de santé publique associé à l'antibiothérapie dans les pays industrialisés. La diarrhée associée à C. difficile est actuellement la diarrhée nosocomiale la plus fréquente en Europe et dans le monde. Depuis la dernière décennie, la proportion de formes d'infections graves a augmentée en raison de l'émergence des souches hypervirulantes et épidémiques comme la souche R20291 de ribotype 027. L'infection à C. difficile provoque la diarrhée, la colite et même la mort. De nombreux aspects de la pathogenèse de C. difficile restent mal compris. En particulier, les mécanismes moléculaires de son adaptation aux conditions changeantes de l'hôte doivent être examinés.Durant le cycle d'infection, C. difficile survit dans des communautés intestinales riches en bactériophages, en utilisant des systèmes qui contrôlent les échanges génétiques favorisés dans ces environnements complexes. Au cours de la dernière décennie, les systèmes CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (associés aux CRISPR) d'immunité adaptative chez les procaryotes contre des éléments génétiques exogènes sont devenus le centre d'intérêt scientifique parmi les divers systèmes de défense bactérienne.Des études antérieures ont révélé la présence d'ARN CRISPR abondants chez C. difficile. Cette bactérie possède un système CRISPR original, caractérisé par la présence d'un grand nombre de cassettes CRISPR (12 dans la souche 630 et 9 dans la souche hypervirulante R20291), de deux ou trois opérons cas conservés dans la majorité des génomes séquencés de C. difficile et la localisation au sein des prophages de plusieurs cassettes CRISPR. Cependant, le rôle de CRISPR-Cas dans la physiologie et le cycle infectieux de cet important pathogène reste obscur.Les objectifs de ce travail sont les suivants:1) étudier le rôle et la fonctionnalité du système CRISPR-Cas de C. difficile dans les interactions avec des éléments d'ADN étrangers (tels que les plasmides), 2) révéler la manière dont le système CRISPR-Cas de C. difficile est régulé et fonctionne dans des conditions de culture bactérienne différentes, incluant la réponse aux stress.Dans la présente thèse, la fonctionnalité du système CRISPR-Cas de C. difficile a été étudiée (chapitre 2). Grâce à des tests d'efficacité de conjugaison, la fonction défensive (en interférence) du système CRISPR-Cas a été démontrée. La corrélation entre les niveaux d'expression des ARN CRISPR et les niveaux d'interférence observés a également été montrée. De plus, grâce à la série d'expériences d'interférence, la fonctionnalité des motifs PAM (protospacer adjacent motifs) a été confirmée en accord avec des prédictions in silico. Le consensus fonctionnel de PAM a été déterminé expérimentalement avec les bibliothèques des plasmides. La fonction adaptative du système CRISPR-Cas de C. difficile a été également démontrée pour la souche de laboratoire. Le rôle de plusieurs opérons cas dans la fonctionnalité du système CRISPR de C. difficile est démontré aussi dans ce chapitre.Le chapitre 3 montre le lien entre le système CRISPR-Cas et un nouveau système toxine-antitoxine de type I, ainsi que leur possible co-régulation dans des conditions de biofilm et de stress. Ce chapitre définit également le rôle possible du c-di-GMP dans la régulation du système CRISPR-Cas de C. difficile. De plus, le chapitre 4 décrit l'utilisation du système CRISPR-Cas endogène comme nouvel outil pour la rédaction du génome de C. difficile.En conclusion, les données obtenues mettent en évidence les caractéristiques originales du système CRISPR-Cas actif de C. difficile et démontrent son potentiel biotechnologique.