Study of the intramolecular activation mechanism of the deubiquitinase USP7
Étude du mécanisme d'activation intramoléculaire de la déubiquitinase USP7
par Lionel ROUGÉ sous la direction de Daniel LADANT
Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé. Biologie cellulaire et moléculaire
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le mardi 17 septembre 2019 à Université de Paris (2019-....)

Sujets
  • antagonistes et inhibiteurs
  • Ingénierie des protéines
  • métabolisme
  • Ubiquitine
  • Ubiquitin-specific peptidase 7

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Mots clés
Deubiquitinase (DUB), P53, Biologie structurelle
Resumé
Les protéines sont soumises à de nombreuses régulations durant leur cycle de vie. L'ubiquitination est au centre du « système ubiquitine-protéasome » (ou UPS) qui constitue un des systèmes majeurs responsable de la dégradation et du recyclage des protéines grâce au protéasome 26S. Ce système est basé sur l'addition de façon covalente d'une protéine de 76 résidus appelée l'ubiquitine sur la protéine substrat grâce à une succession de trois réactions enzymatiques. Par la suite, de nouvelles ubiquitines peuvent être ajoutées de façon covalente à l'ubiquitine initiale formant des chaînes de poly-ubiquitine. Ce procédé d'ubiquitination est réversible et utilise des enzymes de désubiquitination dites deubiquitinases (DUBs) afin de retirer les chaînes d'ubiquitine permettant ainsi aux substrats de retrouver leur état natif. La protéase spécifique de l'ubiquitine (USP) n° 7 est une DUB qui joue un rôle majeur dans différents procédés cellulaires et notamment dans la régulation de p53, un facteur de transcription impliqué dans le maintien de l'intégrité du génome, ainsi que de son ubiquitine ligase MDM2. Compte tenu de son rôle clef dans de nombreux mécanismes cellulaires, la régulation de son activité est facilitée par son organisation sous forme de multiples domaines. Dans sa région N-terminale, USP7 possède un domaine TRAF impliqué dans la reconnaissance des substrats (comme p53 et MDM2) suivi d'un domaine catalytique (CD) puis de cinq domaines similaires à l'ubiquitine (ubiquitin-like domains ou UBL) egalement impliqués dans la reconnaissance de substrats (comme DNMT1 ou ICP0). Enfin, la protéine se termine par une région peu caractérisée composée d'une vingtaine d'acides aminés et décrite comme essentielle pour récapituler l'activité enzymatique.Une série d'études enzymatiques ont démontré que le domaine catalytique d'USP7, lorsque isolé des autres domaines, possède une faible activité. En effet, en absence de substrat, la triade catalytique n'est pas correctement orientée, empêchant toute activité protéolytique. En revanche, la structure du domaine catalytique en présence d'ubiquitine révèle un changement conformationnel important réalignant sa triade catalytique mais aussi permettant d'accommoder l'ubiquitine. Un important réarrangement est observé au niveau d'une boucle (appelée "switching loop") qui passe d'une conformation inhibitrice en absence d'ubiquitine à une conformation active lorsque l'ubiquitine est présente. Au-delà du domaine catalytique, les structures des différents domaines d'USP7 ont été déterminées et ont permis de caractériser les principaux mécanismes moléculaires utilisés par USP7 pour reconnaître ses multiples substrats. En revanche, l'organisation intra-domaines dans le contexte de la protéine dans sa totalité reste assez floue. Afin d'élucider les différents mécanismes régulateurs contrôlant son activité, nous avons tout d'abord validé l'importance de la région localisée au C-terminal d'USP7 dans l'activation de cette enzyme. Utilisant diverses méthodes (ingénierie des protéines, enzymologie et cristallographie), nous avons ainsi démontré que cette séquence permet de stabiliser la « switching loop » dans une conformation active lorsque l'ubiquitine est présente. Nous sommes également parvenus à obtenir deux autres structures (USP7CD-UBL123 et USP7CD-UBL45-CTP en complexe avec l'ubiquitine) suggérant un possible agencement des UBLs à proximité du domaine catalytique et nous permettant ainsi de proposer un modèle d'activation pour USP7. Ce modèle a été testé par électron microscopie et suggère que les échantillons analysés requièrent de l'optimisation. Notre étude révèle un mécanisme de régulation intramoléculaire d'USP7, à ce jour unique dans la famille des DUBs. Compte tenu du rôle majeur joué par USP7 dans de nombreux procédés cellulaires et par conséquent de son intérêt thérapeutique, ces résultats ont le potentiel d'aider au développement d'inhibiteurs spécifiques.