Etude des mécanismes moléculaires de l'initiation de la traduction de l'ARN génomique du VIH-1
Molecular mechanisms of translation initiation of the genomic RNA of HIV-1
par Deforges Jules sous la direction de Sargueil Bruno
Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire
École doctorale Médicament, Toxicologie, Chimie, Imageries

Soutenue le Thursday 27 March 2014 à Université Paris Descartes ( Paris 5 )

Sujets
  • ARN viral
  • Site d'entrée interne des ribosomes
  • Traduction génétique
  • VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1)
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Mots clés
ARN, Traduction, IRES, Initiation ribosome, VIH-1, Structure secondaire, SHAPE, Biologie moléculaire, Dimérisation, Virus
Resumé
L'ARN génomique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est multifonctionnel et suit au moins deux destins. Soit il est traduit par la machinerie traductionnelle de l'hôte donnant naissance aux polyprotéines Gag et Gag-pol, soit il se dimérise et est encapsidé dans les virions en tant que génome viral. Les travaux du laboratoire visent à identifier les mécanismes moléculaires de la traduction de l'ARN génomique et de sa dimérisation, ainsi que les déterminants gouvernant la balance entre ces deux phénomènes. La traduction de l'ARN génomique viral peut être initiée de trois façons. Selon le mécanisme canonique nécessitant la présence d'une coiffe à l'extrémité 5' de l'ARN, et grâce à deux sites d'initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Un IRES a été mis en évidence dans la 5' UTR, dont l'activité est stimulée lors en phase G2/M du cycle cellulaire uniquement. Un second IRES a été découvert dans la région codante de gag. Il est capable de lier directement la petite sous-unité ribosome et le facteur d'initiation eIF3, et permet l'initiation à partir de deux codons AUG situés dans la même phase de lecture, conduisant à la synthèse d'une isoforme additionnelle de Gag. Mon projet de thèse a consisté en l'étude de l'influence de la structure secondaire sur la traduction et la dimérisation. Dans un premier temps, j'ai mis en place au laboratoire une nouvelle technique de sondage de structure, appelée « SHAPE », développée par le laboratoire de K. Weeks. Le SHAPE nous permet désormais de sonder rapidement la structure secondaire de nombreux ARN, et notamment de tester en routine l'effet de mutations sur la structure secondaire. Cette technique a permis d'étudier la structure secondaire de la 5' UTR dans différentes conditions. Nous avons ainsi identifié une signature de la conformation monomère de la 5 UTR, et découvert un nouvel élément impliqué dans la dimérisation in vitro. Par ailleurs, nous avons montré que des extraits de cellules Hela synchronisées en phase G2/M du cycle cellulaire stimulent l'activité de l'IRES de la 5' UTR et modifient le profil de réactivité de cette région, traduisant probablement une réorganisation structurale induite par le recrutement de protéines cellulaires. Une autre partie de mon projet de thèse a concerné l'étude de l'IRES de la région codante de gag, Des délétions progressives de l'IRES, à partir des extrémités 5' et 3' ont mis en évidence l'existence de deux sites de liaison distincts au ribosome, localisés à proximité de chacun des deux codons d'initiation. La délétion de chaque site a permis de confirmer le rôle de la liaison directe au ribosome dans la traduction de gag. L'ensemble de ces éléments nous permet de proposer un modèle moléculaire conduisant à la formation des complexes d'initiation sur chaque codon AUG. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu'une interaction longue-distance entre la boucle PolyA et la région codante de gag régule de la traduction de l'ARN génomique. Un tel mécanisme pourrait permettre de réguler l'efficacité de traduction du gène gag, voire du ratio entre les deux isoformes au cours du cycle réplicatif.