Rôle de la O-GlcNAcylation dans les effets pro-inflammatoires du LPS dans le macrophage
Role of O-GlcNAcylation on the pro-inflammatory effects of LPS in macrophages
par Baudoin Léa sous la direction de Issad Tarik
Thèse de doctorat en Physiologie
École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le Friday 07 April 2017 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • Aspect moléculaire
  • Macrophages
  • Protéines -- Métabolisme
  • Troubles du métabolisme
Un embargo est demandé par le doctorant jusqu'au 19 April 2020
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Mots clés
O-GlcNAcylation, Macrophages, Maladies métaboliques, Inflammation, LPS
Resumé
Au cours des dernières décennies, les modifications comportementales ont conduit à une forte augmentation de la prévalence des maladies métaboliques comme l'obésité et le diabète de type 2. L'hyperglycémie chronique associée à ces maladies a des effets délétères sur de nombreux tissus, entraînant de graves complications (glucotoxicité). Parmi les différents mécanismes impliqués dans les effets toxiques du glucose, la O-N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAc) des protéines joue un rôle très important. La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle réversible qui régule l'activité des protéines cytosoliques et nucléaires en fonction de la disponibilité en glucose. Deux enzymes seulement, l'O-GlcNAc transférase (OGT) et l'O-GlcNAcase (OGA), ajoutent ou retirent le groupement GlcNAc sur les protéines, respectivement. Cette modification dépend étroitement de la disponibilité en glucose et de son flux à travers la voie de biosynthèse des hexosamines (HBP). Les maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité se caractérisent par ailleurs par une inflammation chronique à bas bruit, qui participe également aux complications observées dans ces pathologies. Les perturbations métaboliques associées à ces maladies (augmentation des acides gras libres et du glucose) favorisent les processus pro-inflammatoires dans le macrophage. Cependant, les relations entre processus inflammatoires et O-GlcNAcylation des protéines restent peu explorées. Le but de ce travail était d'évaluer l'implication de la voie de O-GlcNAcylation dans le macrophage. Les études ont été réalisées en utilisant la lignée de macrophages murins RAW264.7 ou des macrophages, différenciés à partir de moelle osseuse de souris, des macrophages péritonéaux de souris ou des macrophages différenciés à partir à de monocytes humains. La O-GlcNAcylation des protéines a été mesurée dans les macrophages RAW264.7 à l'aide d'un biosenseur BRET adressé dans différents compartiments cellulaires. Nous avons observé que l'activation du Toll-like receptor (TLR) 4 par le LPS (lipopolysaccharide) augmente le signal de BRET à la membrane plasmique, dans le cytosol et le noyau des cellules RAW264.7. Une augmentation de la O-GlcNAcylation induite par le LPS était également observée par western blotting dans les cellules RAW264.7 et dans les macrophages primaires de souris et humains. Cette augmentation de O-GlcNAcylation était en particulier détectée sur la sous-unité p65 du facteur de transcription NFκB, suggérant un rôle de cette modification dans les effets pro-inflammatoires du LPS. En accord avec cette notion, l'inhibition de l'OGA, (responsable de la dé-GlcNAcylation des protéines) à l'aide d'un inhibiteur spécifique (Thiamet G), potentialise les effets du LPS sur l'expression des ARNm de la cytokine pro-inflammatoire IL1β. Nous avons en outre généré un modèle de souris OGT-KO inductible au tamoxifène. L'invalidation de l'OGT dans les macrophages primaires de ces souris réduit l'effet du LPS sur l'expression des ARNm de l'IL1β d'un facteur 2, suggérant que l'induction de la O-GlcNAcylation est au moins en partie impliquée dans la transmission des effets pro-inflammatoires du LPS. Afin d'élucider les mécanismes responsables de l'augmentation de O-GlcNAcylation induite par le LPS, nous avons étudié, dans les cellules RAW264.7, l'effet du LPS sur les enzymes impliquées dans la voie O-GlcNAc. Nous avons observé que le traitement au LPS n'a pas d'effet sur l'expression (ARNm et protéine) et sur les activités enzymatiques de l'OGT et de l'OGA. En revanche, le LPS induit une forte augmentation de l'expression (ARNm et protéine) de la glutamine : fructose-6-phosphate amidotransférase (GFAT), enzyme limitante de la voie HBP. (...)