Développement d'une sonde de photoaffinité pour la détection sensible de formes actives de Métalloprotéases Matricielles dans des systèmes biologiques complexes
Developpement of a photoaffinity probe for the sensitive detection of Matrix Metalloprotease active forms from complex biological systems
par Nury Catherine sous la direction de Dive Vincent
Thèse de doctorat en Biologie et biotechnologie
École doctorale Médicament, Toxicologie, Chimie, Environnement

Soutenue le Monday 26 November 2012 à Université Paris Descartes ( Paris 5 )

Sujets
  • Analyse
  • Diazirines
  • Inhibiteur tissulaire de métalloprotéinase-1
  • Lavage bronchoalvéolaire
  • Métalloprotéinases matricielles

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Mots clés
MMPs,Métalloprotéases matricielles,Sonde de photoaffinité,APB,Activity-based probe,Diazirine,Inhibiteur phosphinique peptidique,MMP-12,Fluide lavage bronchoalvéolaire
Resumé
Le développement d'une nouvelle sonde dite « activity-based probe » pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d'un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu'avec cette nouvelle sonde qu'il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l'ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l'analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l'analyse de carotides humaines de patients souffrant d'athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l'avenir de tester d'autres fluides pathologiques d'origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.