Functional analysis of artificial DNA reaction network
Analyse fonctionnelle du réseau de réaction ADN artificiel
par Baccouche Alexandre sous la direction de Rondelez Yannick
Thèse de doctorat en Chimie
École doctorale Médicament, Toxicologie, Chimie, Imageries

Soutenue le Friday 18 December 2015 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • ADN
  • Biologie moléculaire
  • Microfluidique
  • Microscopie confocale

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Mots clés
Programmation moléculaire, Réseau de réactions, Microfluidique, Bifurcation, Microscopie confocale, Bistabilité, Prédateur-proie
Resumé
La gestion et transmission d'information au sein d'organismes vivants implique la production et le trafic de molécules via des voies de signalisation sutructurées en réseaux de réactions chimiques. Ces derniers varient selon leur forme, taille ainsi que la nature des molécules mises en jeu. Parmi eux, les réseaux de régulation génétiques nous ont servi de modèle pour le développement et la mise en place d'un système de programmation moléculaire in vitro. En effet, l'expression d'un gène est majoritairement dominé par des facteurs de transcription, autres protéines ou acides nucléiques, eux-mêmes exprimés par d'autres gènes. L'ensemble forme l'interactome de la cellule, carte globale des interactions entre gènes et sous-produits, où la fonction du réseau est relié à sa topologie. L'observation des noeuds et sous-architectures dénote trois mécanismes récurrents : premièrement, la nature des interactions est de type activation ou inhibition, ce qui implique que tout comportement non trivial est obtenu par une combinaison de noeuds plutôt que le développement de nouvelles interactions. Ensuite, la longévité du réseau est assurée par la stabilité chimique de l'ADN couplée à la chimiosélectivié des réactions enzymatiques. Enfin, l'aspect dynamique est maintenu par le constant anabolisme/catabolisme des intermédiaires et donc l'utilisation de combustible/énergie. C'est suivant ces observations que nous avons développé un ensemble de trois réactions enzymatiques élémentaires : la «PEN-DNA toolbox». L'architecture du réseau, à savoir les connections entre les noeuds est médiée par la séquence de brins d'ADN synthétiques (appelés matrice), et trois enzymes (polymérase, nickase, et exonucléase) assurent la catalyse des réactions chimiques. La production et dégradation des intermédiaires consomme des désoxyribonucléotides triphosphates et rejette des désoxyribonucléotides monophosphate, dissipant ainsi le potentiel chimique. Les réactions sont suivies grâce au greffage d'un fluorophore sur le brin matriciel et au «nucleobase quenching» qui intervient lorsqu'une base d'un intermédiaire se rapproche du fluorophore après hybdridation sur le brin matriciel. L'activation correspond alors à la synthèse d'un brin output en réponse à un brin input, alors que l'inhibition survient lorsqu'un brin output s'hybride sur un brin matriciel, empêchant ainsi à l'input correspondant de s'y fixer. Oscillations, bistabilité et mémoire sont des exemples de comportements implémentés en PEN-DNA toolbox, faisant appel à des architectures de plus en plus complexes. Pour cela, un réglage fin des concentrations en effecteurs (ADN et enzymes) est nécessaire, ce qui sous-tend l'existence de plusieurs comportements pour un même circuit, dépendant des conditions paramétriques. L'établissement d'une carte de chaque combinaison de paramètres avec le comportement global associé permettrait de comprendre le fonctionnement du réseau dans son ensemble, et donnerait accès à tous les comportements disponibles. Dans le cas d'un système dynamique non linéaire, une telle carte est un diagramme de bifurcation du système. Pour explorer de manière exhaustive les possibilités d'un réseau dans un cadre expérimental raisonable, nous avons développé une plateforme microfluidique capable de générer des goutelettes d'eau dans l'huile à partir de quatres canaux aqueux différents. Ce dispositif nous donne accès, grâce à un contrôle fin des contributions de chaque canal aqueux, à des goutelettes monodisperses (volume de l'ordre du picolitre) dont le contenu est différent pour chaque goutelette. Nous avons adapté notre dispositif aux contraintes matérielles (design microfluidique, génération de goutelettes à contenu différents et controllés, observation et stabilité à long terme) et techniques (tracabilité des goutelettes et stabilité/compatibilité chimique). (...)