Pompe d'efflux, Liposomes, Protéoliposomes, Vitesse, Transport, Résistance antibiotiques, Cryo-EM, MexAB-OprM, Inhibiteurs

La résistance aux antibiotiques est un phénomène qui prend beaucoup d'ampleur dans notre société. En effet, les bactéries ont développé de nombreux systèmes de défense. Parmi elles, les pompes d'efflux sont des complexes protéiques responsables du transport d'antibiotiques en dehors de la bactérie. Elles sont classées en fonction de l'énergie qu'elles utilisent pour effectuer le transport (hydrolyse de l'ATP ou transport d'un contre-ion). Chez les bactéries à Gram négatif, les pompes d'efflux de la famille des RND (résistance, Nodulation et Division cellulaire) utilisent un gradient de protons pour être actives : un transporteur RND situé dans la membrane interne, une protéine située dans la membrane externe (OMF) et enfin une protéine périplasmique (MFP) permettant de stabiliser le complexe tripartite. Au laboratoire, nous travaillons sur la pompe d'efflux MexA-MexB-OprM de Pseudomonas aeruginosa. En 2014, la mesure qualitative du transport de protons et de substrat a pu être réalisée, après reconstitution de la pompe d'efflux MexA-MexB-OprM en protéoliposomes. Pour ce faire, MexA et MexB sont reconstitué dans un premier protéoliposome, et OprM dans un second. L'assemblage du complexe tripartite a alors permis d'effectuer ces mesures. En continuité avec les travaux précédents, le but de mon projet de thèse consiste à mesurer des vitesses de transport de protons et de substrat de la pompe d'efflux MexA-MexB-OprM, après reconstitution en protéoliposomes, et rendre ainsi les mesures quantitatives. Cela nécessite de déterminer l'efficacité de reconstitution des protéines en liposomes, ainsi que la détermination du nombre de protéines par liposomes. De plus, nous avons mis au point un protocole utilisant un appareil de Stopped-flow, permettant de mesurer des vitesses dans les premiers instants de transport. Nous avons ainsi pu estimer qu'il y avait environ deux protéines MexB par liposome, et qu'environ 15 000 protons étaient nécessaires pour le transport de substrat, par seconde. Ces résultats, en lien avec des structures obtenues en microscopie électronique pour la protéine MexB seule et au sein du complexe tripartite, nous ont permis de mieux comprendre le fonctionnement de la pompe d'efflux