Neutrophiles, P47phox, NADPH oxydase, Phosphorylation, Zymosan opsonisé, Espèces réactives de l'oxygène (ERO), Fc-Gamma R, CR3, Kinase Src, Kinase Syk, PI3K, PLC, PKC-Beta2

Les polymorphonucléaires neutrophiles, sont des acteurs essentiels du système immunitaire inné, responsables de la phagocytose des agents pathogènes. Lors de la phagocytose, les neutrophiles produisent des quantités substantielles d'anion superoxyde, qui génèrent ensuite des espèces réactives de l'oxygène (ERO) telles que le peroxyde d'hydrogène, les radicaux hydroxyles et l'acide hypochloreux, indispensables à la destruction des microbes. L'enzyme responsable de la production de superoxyde est le complexe NADPH oxydase, composé de protéines membranaires (gp91phox/NOX2 et p22phox) et de protéines cytosoliques (p47phox, p67phox, p40phox et Rac1/2). Lors de l'activation, ces composants cytosoliques transloquent vers la membrane, entraînant l'assemblage et l'activation de l'enzyme. Une régulation adéquate de l'activité de la NADPH oxydase est essentielle pour équilibrer une élimination efficace des pathogènes et éviter les dommages tissulaires excessifs dus aux ERO. L' objectifs de ma thèse vise à examiner la phosphorylation de la p47phox dans les neutrophiles humains stimulés par le zymosan opsonisé par le sérum (OZ), un agent connu pour induire la phagocytose. Nous nous concentrons sur l'identification des sites de phosphorylation spécifiques et l'élucidation des voies de signalisation impliquées dans ce processus. Les neutrophiles humains ont été isolés du sang veineux de volontaires sains par sédimentation au Dextran et centrifugation sur Ficoll. Le zymosan a été opsonisé en utilisant du sérum autologue riche en immunoglobulines (IgG) et en protéines du complément (C3b et C3bi). Les neutrophiles ont ensuite été stimulés avec du zymosan non opsonisé ou opsonisé, et la phosphorylation de p47phox a été évaluée par SDS-PAGE et Western blot avec des anticorps spécifiques. La production de ROS a été mesurée en utilisant la chimioluminescence amplifiée par le luminol. La microscopie confocale a été utilisée pour visualiser les interactions des neutrophiles avec le zymosan opsonisé fluorescent. Divers inhibiteurs de kinases ont été utilisés pour disséquer les voies de signalisation conduisant à la phosphorylation de p47phox. Les résultats montrent que le zymosan opsonisé par le sérum (OZ) a induit une phosphorylation rapide et transitoire de p47phox aux sites Ser304, Ser315, Ser320 et Ser328, détectable en 20 secondes et atteignant un pic à 40-60 secondes. Cette phosphorylation diminue sur 10 minutes, tandis que la production de ROS est restée soutenue pendant plus de 30 minutes. Le zymosan non opsonisé n'a pas induit de phosphorylation significative ni de production de ROS. La phosphorylation a eu lieu lors du contact avec le OZ, avant la phagocytose, et a été principalement induite par les opsonines IgG et C3bi via leurs récepteurs respectifs, Fc-gamma R et CR3. Les études utilisant des inhibiteurs ont révélé que les kinases tyrosine Src et Syk, PI3K, PLC, PLD, le calcium et PKC-beta2 sont essentiels pour la phosphorylation de p47phox et l'activation subséquente de la NADPH oxydase. Cette étude élucide les événements de phosphorylation spécifiques et les voies de signalisation qui régulent l'activation de la NADPH oxydase dans les neutrophiles humains pendant la phagocytose. Le zymosan opsonisé par le sérum induit une phosphorylation rapide de p47phox aux sites Ser304, Ser315, Ser320 et Ser328, nécessaire pour initier mais non maintenir l'activité de la NADPH oxydase. Les IgG et C3bi sont les principales opsonines conduisant ce processus via les récepteurs Fc-gamma R et CR3. Les voies de signalisation clés impliquent les kinases tyrosine Src et Syk, PI3K, PLC, PLD, le calcium et PKC-beta2. Ces résultats améliorent notre compréhension de l'activation des neutrophiles et offrent des cibles thérapeutiques potentielles pour moduler les réponses immunitaires.