Replication ADN, Transcription, Origine de replication, CFS, ERFS, DT40

La réplication fidèle du génome des vertébrés est un processus essentiel au maintien de son intégrité. Elle est initiée selon un programme temporel bien orchestré de déclenchement des origines de réplication. En condition de stress réplicatif, deux types de régions chromosomiques sont susceptibles de subir une instabilité génomique. Les sites fragiles de réplication précoce (ERFS) sont caractérisés par une forte densité en gènes courts fortement transcrits contenant des R-loops ainsi qu'en origines de réplication efficaces. Au contraire, les sites fragiles communs (SFC) sont localisés dans des régions tardives contenant des gènes très longs et modérément exprimés. Dans ces régions, l'instabilité est associée à un appauvrissement des événements d'initiation corrélé à la transcription. Ces observations ont conduit à une hypothèse sur la formation des SFC, selon laquelle la transcription peut activement éliminer les complexes de pré-réplication, limitant le déclenchement d'origines dans ces longs gènes. Nous avons étudié comment la transcription interfère avec l'initiation de la réplication au niveau d'un SFC et d'une région ayant certaines propriétés des ERFS dans des lignées cellulaires aviaires DT40 modifiées. Nous avons d'abord analysé l'activité d'une origine de réplication minimale et efficace insérée au milieu de la zone dépourvue d'événements d'initiation du gène de la dystrophine (DMD), couvrant 1 Mb et se répliquant tardivement. Le gène DMD, naturellement silencieux et non fragile dans la DT40, devient fragile lorsqu'il est placé sous le contrôle d'un promoteur TetOn inductible. Lorsque la transcription est induite, celle-ci progresse à travers l'origine, diminuant drastiquement son activité. Ce résultat est en accord avec le modèle proposé de formation des SFC. Nous avons ensuite analysé l'effet du passage de la transcription induite par le promoteur fort b-actine sur la même origine minimale dans une région répliquée en milieu de phase S. Nous avons observé que le passage de la machinerie de transcription n'inhibe pas son déclenchement. La transcription progresse au-delà de l'origine minimale, suggérant que les deux machineries peuvent coexister sur le même substrat. De plus, des analyses du moment de réplication ont montré que l'origine minimale coopère avec l'origine présente dans le promoteur b-actine pour avancer le moment de réplication de la région qui devient précoce. Cette configuration ressemblant aux ERFS, nous avons testé la stabilité de la région modifiée. Contrairement aux ERFS précédemment décrits dans la DT40, cette configuration n'induit pas le recrutement de g-H2AX lors d'un stress réplicatif. Ces résultats suggèrent que la transcription affecte différemment l'initiation de la réplication dans deux contextes génomiques distincts. Le contexte de réplication tardive est répressif, alors que le contexte précoce ne l'est pas. Pour approfondir cette question, nous avons testé un troisième contexte, une région de réplication tardive non génique. Des résultats antérieurs ont montré que la combinaison de l'origine complète b-globine avec l'origine b-actine avançait de manière significative le moment de réplication. Nous avons montré que l'origine minimale modèle insérée seule dans ce troisième contexte chromosomique est réprimée, alors que l'origine b-actine est active. Lorsque les deux origines modèles sont insérées à proximité, l'origine minimale devient fonctionnelle. Globalement, ce dernier contexte chromosomique se comporte différemment des deux précédents. L'origine minimale efficace ne peut fonctionner dans ce contexte très répressif que lorsqu'elle est associée à une transcription active. Ce dernier résultat confirme la forte influence de l'environnement chromosomique sur la fonction d'une origine. Ce travail contribue à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent la formation des sites fragiles et l'établissement des domaines chromosomiques du moment de réplication.