| Resumé |
La dégradation des ARNm est utilisée par les procaryotes et les eucaryotes pour contrôler l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. Les ribosomes bactériens peuvent protéger les ARNm de la dégradation en bloquant la progression des exoribonucléases 5'-3' ou en masquant les sites de clivage des endoribonucléases. En 2017, le laboratoire a identifié une nouvelle endoribonucléase chez B. subtilis, YacP. YacP a été renommée Rae1 pour « Endoribonucléase Associée au Ribosome 1 » car, contrairement à la plupart des ribonucléases identifiées chez les Firmicutes, Rae1 clive les ARNm de manière dépendante de la traduction. Un transcriptome a permis d'identifier deux substrats de Rae1 : les opérons yrzI et bmrBCD. Au sein de l'opéron yrzI, le site de clivage a été cartographié dans une ORF appelée S1025, codant un peptide de 17 acides aminés de fonction inconnue. Le clivage de S1025 par Rae1 nécessite que S2015 soit traduit dans le bon cadre de lecture. Le but de mon doctorat a été de déterminer comment Rae1 reconnaît et clive ses cibles ainsi que son rôle dans cette bactérie. Nous avons cartographié le site de clivage au sein de l'opéron bmrBCD dans une ORF non annotée de 26 acides aminés, nommée bmrX. Comme pour S1025, bmrX contient un site de clivage bona fide et transposable de Rae1 et le clivage de bmrX par Rae1 est dépendant de la traduction et du cadre de lecture. Après clivage par Rae1, la voie de trans-traduction de l'ARNmt permet de recycler les ribosomes bloqués sur les ARNm. L'identification récente de SmrB chez E. coli et de son homologue MutS2 chez B. subtilis comme un senseur de collision de ribosomes, nous a amené à tester si Rae1 pouvait agir en coopération avec MutS2. SmrB et MutS2 sont homologues à l'endoribonucléase CUE2 impliquée dans le processus de No Go Decay (NGD) chez Saccharomyces cerevisiae. Cependant, Rae1 clive ses substrats indépendamment de MutS2. Ces données ont été publiées dans le journal RNA (Deves et al., 2023). La seule caractéristique commune des deux cibles de Rae1, bmrX et S1025, est que le site de clivage est localisé à 12 nucléotides (nts) en amont du codon stop. Déplacer le codon stop plusieurs codons en aval réduit fortement le clivage par Rae1, alors que le replacer dans sa position d'origine dans ce nouveau contexte rétablit le clivage, indiquant que Rae1 requiert un codon stop à 12 nts du site de clivage pour couper l'ARNm. Nos expériences de toeprinting suggèrent que le ribosome pause sur le transcrit S1025 avec son site A au niveau du codon stop, suggérant que Rae1 cliverait 12 nts en amont d'un ribosome en pause sur un codon de terminaison de la traduction particulièrement lent. La délétion des 3 premiers codons de S1025 n'affecte pas le clivage, suggérant qu'ils ne participent pas à la pause du ribosome. L'ARNm fliY codant une protéine du flagelle qui contient un motif SPP, sur lesquel le ribosome pause en l'absence du facteur d'élongation P (EF-P), est une troisième cible de Rae1. La mutation du motif SPP réduit la déstabilisation de l'ARNm initiée par Rae1, indiquant que la pause du ribosome est requise pour ce clivage. Cependant, une pause de ribosome seule n'est pas suffisante pour promouvoir la dégradation par Rae1, puisque dix autres ARNm possédant des motifs polyproline se sont révélés insensibles à Rae1 dans une souche délétée du gène efp. Rae1 clive l'ARNm fliY à 12 nts du codon proline situé dans le site A du ribosome, de façon similaire au clivage par Rae1 à 12 nts du codon stop de S1025 et bmrX. Ces résultats indiquent que le clivage effectué par Rae1 requiert un site localisé à 12 nts du site A d'un ribosome en pause. Ce travail a permis la découverte d'un nouveau mécanisme de régulation de l'expression génique mettant en jeu le ribosome, analogue à ceux qui interviennent dans la régulation des gènes fournissant une résistance aux antibiotiques (ermC, msrD) ou répondant à la carence en tryptophane (opéron trp, tnaC). Ces données font l'objet d'une publication e |