Cellules natural killers, Chimeric antigen receptor, Édition génique, CRISPR/Cas9, AAV6, Rétrovirus, Promoteur, TIGIT, CD3z

L'introduction des cellules CAR-T a révolutionné la prise en charge clinique de certains cancers, en particulier des hémopathies malignes. Plus récemment, les cellules Natural Killers (NK), qui présentent une activité antitumorale innée, sont apparus comme une plateforme cellulaire alternative pour le développement de nouvelles cellules immunitaires exprimant un CAR. Les CAR-NK pourraient en théorie surmonter certaines difficultés rencontrées avec les CAR-T, en particulier en contexte allogénique. Mais malgré de premiers succès cliniques (Liu et al., NEJM, 2020), les CAR-NK restent une approche moins mature que les CAR-T, dont l'optimisation se heurte à un ensemble de problématiques à la fois techniques et biologiques. Notre hypothèse est que les CAR-NK pourraient bénéficier des techniques modernes d'édition génique, en particulier de l'intégration ciblée du transgène CAR dans un locus cible en comparaison aux vecteurs rétroviraux classiquement utilisés résultant en une intégration semi-aléatoire du transgène. Cette approche s'avère très bénéfique dans le contexte des cellules CAR-T et du locus du TCR alpha (Eyquem et al., Nature, 2017). Dans une première partie, nous décrivons l'optimisation d'un protocole d'édition génique adapté aux cellules NK humaines primaires. Nous établissons une stratégie robuste de Knock-out et de Knock-in reposant sur l'utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 en combinaison avec l'utilisation de particules virales (AAV6) pour la délivrance du transgène. Cette technique est ensuite appliquée à la génération de CAR-NK. L'expression ubiquitaire et constitutive forte de la Beta-2 microglobuline (B2M) en fait un locus prometteur pour l'intégration d'un CAR sous contrôle de son promoteur endogène. Le transgène est conçu pour assurer le sauvetage du gène B2M lors du Knock-in, permettant le maintien d'une expression intermédiaire de B2M. Cette stratégie permet d'obtenir des CAR-NK présentant un fort niveau d'expression du CAR, plus homogène qu'avec une approche rétrovirale, et offre une protection contre l'attaque fratricide secondaire à la perte complète d'expression des molécules du HLA de classe I résultant du knock-out de B2M. Fonctionnellement, nous montrons que les cellules B2M CAR-NK ainsi générées présentent une cytotoxicité accrue in vitro dans différents modèles de tumeurs CD19+ en comparaison aux cellules NK WT. Néanmoins, malgré leurs caractéristiques avantageuses, les cellules B2M CAR-NK se révèlent inferieures à des CAR-NK générés par approche rétrovirale, en particulier dans un modèle tumoral murin de xénogreffe de tumeur ovarienne humaine. Ces observations nous conduisent, dans une seconde partie, à étendre cette approche en explorant un ensemble de loci alternatifs, pertinents dans la physiologie des cellules NK (récepteurs activateurs ou inhibiteurs), pour y intégrer un CAR. Pour les récepteurs activateurs, le transgène est conçu pour utiliser le promoteur endogène du gène cible et maintenir l'expression du locus cible, alors que dans le cas des récepteurs inhibiteurs, le transgène est placé sous la régulation d'un promoteur exogène aboutissant à la perte d'expression du gène ciblé. En suivant cette approche, nous identifions des loci d'intégration supérieurs à B2M dans des expériences de cytotoxicité in vitro, dont nous décrivons l'efficacité in vivo dans le modèle murin préalablement décrit. Par la suite, TIGIT est choisi comme locus de référence pour comparer différentes variations du design du transgène CAR, comme l'utilisation de multiples promoteurs exogènes permettant de moduler le niveau d'expression du CAR, ou l'effet de l'altération des motifs ITAM du domaine CD3z du CAR. En conclusion, nos résultats démontrent l'intérêt de l'édition génique de cellules NK primaires dans le développement de nouvelles générations de CAR-NK. Les techniques développées dans cette thèse pourraient aussi s'avérer de puissants outils pour approfondir la connaissance de la biologie des cellules NK.