| Resumé |
Les neutrophiles humains sont les leucocytes les plus abondants et sont en première ligne pour défendre notre corps contre les infections. L'un de leurs mécanismes antimicrobiens les plus intrigants est l'éjection de filaments d'ADN en forme de filet, ornés de protéines nucléaires et granulaires antimicrobiennes. Ces structures, appelées pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs), servent à piéger puis à tuer les agents pathogènes. Le revers de la médaille est que ces propriétés antimicrobiennes sont également potentiellement toxiques pour l'hôte lorsque les neutrophiles libèrent des NETs de manière inappropriée, contribuant ainsi aux maladies auto-immunes et inflammatoires. Par conséquent, une compréhension approfondie de la formation des NETs pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques et enrichir nos connaissances sur ces maladies. Bien que l'association des NETs avec un grand nombre de pathologies ait été documentée à maintes reprises, la nature des agents déclencheurs des NETs, des signaux de transduction et des événements cellulaires impliqués reste sujet à débat. Durant ma thèse, j'ai cherché à « démêler les NETs » en investiguant précisément comment ils sont générés: -quels stimuli induisent les NETs de manière robuste -quelles voies intracellulaires et quels événements cellulaires sont impliqués -comment la composition des NETs varie en fonction du déclencheur Assez rapidement dans ma thèse, il est devenu évident que la méthode d'isolement utilisée pour obtenir les neutrophiles humains influençait grandement les résultats de mes expériences. J'ai donc commencé par comparer les cinq méthodes d'isolement des neutrophiles les plus couramment utilisées. J¿ai pu démontrer que seuls les neutrophiles faiblement activés, ressemblant aux neutrophiles "intacts" du sang, peuvent répondre et subir une mort cellulaire lytique (en tant qu'indicateur de NETose) en réponse aux stimuli biologiques de la NETose. Ainsi, l'utilisation de différents protocoles et méthodes d'isolement des neutrophiles pourrait en partie expliquer les divergences entre études en réponse aux mêmes stimuli de NETose. Les résultats soulignent la nécessité de protocoles d'isolement des neutrophiles standardisés. J'ai ensuite entrepris une caractérisation approfondie de la génération de NET. J'ai d'abord comparé 31 stimuli de NETose publiés pour identifier un ensemble de stimuli biologiquement pertinents. Étonnamment, seulement 12 (39%) ont induit la NETose de manière robuste dans nos conditions. Pour étudier les voies moléculaires sous-jacentes, j'ai ensuite utilisé des inhibiteurs de diverses molécules de signalisation intracellulaire, ce qui m'a permis d'identifier quatre voies différentes de NETose. Pour étudier les événements cellulaires menant à la formation de NET, j'ai utilisé une approche par microscopie à balayage confocal en temps réel sur des neutrophiles marqués avec des marqueurs fluorescents des organites et stimulés avec des stimuli définis. Selon la stimulation et en fonction du déclencheur, les neutrophiles subissent une série d'événements qui peuvent inclure une vésiculation du réticulum endoplasmique, une décondensation de la chromatine, une perméabilisation progressive de la membrane plasmique, et finalement une rupture de la membrane plasmique avec libération d'ADN extracellulaire. Cette séquence d'événements cellulaires varie en intensité et en cinétique en fonction des stimuli. Enfin, pour déterminer si différents stimuli de NET conduisent à des NET avec une composition spécifique au stimulus, j'ai effectué une analyse par spectrométrie de masse « label-free ». Mes résultats préliminaires semblent indiquer que différents stimuli de NETose induisent un "NETome" spécifique, semblable à une empreinte digitale. Dans l'ensemble, ma thèse contribue à une meilleure compréhension du processus de formation des NETs et de la biologie des neutrophiles in vitro, ainsi qu'à la comparabilité des conditions |