Vésicules extracellulaires, Trafic membranaire, Vectorisation, Bio-ingénierie, Chargement, Syncytin-1, Ciblage, Cas9

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules lipidiques (50 à 150 nm) sécrétées par tous types de cellules. Les VE sont capables de médier la communication intercellulaire entre une cellule donneuse et une cellule receveuse. Pour ce faire, les VE encapsulent un contenu moléculaire (protéine, acide nucléique, molécule de synthèse) et délivrent ce contenu dans le cytosol des cellules receveuses. Cette propriété et la biocompatibilité des VE en font des vecteurs prometteurs pour délivrer des molécules thérapeutiques de tout type. Cependant, la prise en charge des VE est encore largement incomprise et peu efficace, et les acteurs moléculaires sous-jacents demeurent inconnus. Ceci empêche toute stratégie d'ingénierie de la machinerie intrinsèque. Pour pallier à cette problématique, les trois principales stratégies sont le chargement actif du contenu moléculaire, le ciblage par augmentation de l'attachement vésiculaire à une lignée cellulaire spécifique, et la fusion membranaire pour augmenter le transfert cytosolique. Par ailleurs, le domaine de l'ingénierie vésiculaire ne propose pas encore de quantification précise et comparable des différentes stratégies, empêchant les outils développés de trouver une application en clinique. Les travaux ci-présents ont pour objectif de : Générer des outils moléculaires pour les stratégies de chargement, de ciblage et de fusion ; Quantifier la prise en charge et le transfert cytosolique de contenu vésiculaire en suivant directement le contenu vésiculaire pour chaque stratégie ; Apporter une preuve de concept de la pertinence thérapeutique de chaque outils. La stratégie de chargement tire profit de l'utilisation d'un système d'hétéro-dimérisation réversible (système FKBP/FRB) permettant de forcer l'interaction de tout peptide/protéine cytosolique avec un marqueur membranaire de VE. La stratégie de fusion consiste à décorer les VE avec une protéine fusogène humaine, Syncytin-1, que j'ai comparée à l'enveloppe du Virus de la Stomatite Vésiculaire (VSV-G), l'actuel standard. La stratégie de ciblage développée est une méthode versatile de décoration de VE à l'aide d'anticorps permettant d'ancrer des vésicules décorées sur des cellules exprimant l'antigène cible. La quantification de la prise en charge et du relargage vésiculaire a été réalisée par le suivi de la NanoLuciferase, une enzyme produisant de la luminescence utilisée comme contenu vésiculaire témoin. Afin de réaliser des preuves de concept de la pertinence thérapeutique, les VE modifiées ont été utilisées afin de réaliser de l'ablation de tumeur par le relargage de la toxine diphtérique, et également afin de réaliser d'édition génétique par le relargage de la machinerie CRISPR/Cas9. Mes résultats montrent que le système de chargement augmente l'efficacité de prise en charge des VE d'un facteur 4, le système de fusion d'un facteur 5 et le système de ciblage d'un facteur 35. Concernant le relargage du contenu, le système de chargement augmente l'efficacité d'un facteur 4, et le système de fusion d'un facteur 7,5. L'efficacité des vésicules tueuses a été estimée à 80% contre 15% en condition basale, et celle des vésicules éditrices de génome à environ 25% contre 1% sans ingénierie vésiculaire.