Lymphocytes B, Réponse aux dommages à l'ADN, Réparation des cassures double-brin, BioID, Protéomique, Criblages génétiques par CRISPR-Cas9

Afin de synthétiser des immunoglobulines fonctionnelles et diversifiées, les lymphocytes B subissent deux réarrangements génétiques au cours de leur développement : la recombinaison V(D)J et la commutation isotypique de classe. Ces processus sont initiés par la création de cassures d'ADN double-brin (CDB) par le complexe RAG ou AID respectivement. Cela déclenche l'activation de la kinase ATM, qui phosphoryle de multiples protéines de la réponse aux dommages de l'ADN - notamment 53BP1, qui s'accumule aux CDBs. Celles-ci sont réparées par la voie de jonction d'extrémités non homologues (NHEJ), qui met en jeu le complexe de ligation Ligase4/XLF/XRCC4. La réponse aux CDBs induites par RAG et AID présente de multiples différences. Par exemple, la réparation des cassures AID est dépendante de la kinase ATM et son substrat 53BP1, tandis que ces derniers sont accessoires pour la recombinaison V(D)J. Au contraire, les cassures RAG sont réparées exclusivement par le NHEJ, tandis que les cassures AID peuvent être réparées par des voies de réparation alternatives. Enfin, la réponse aux CDBs induites par RAG implique des facteurs présentant des redondances fonctionnelles, comme ATM. En effet, l'absence d'ATM altère la recombinaison V(D)J mais ne l'abroge pas, car elle est compensée par la présence d'autres protéines de la réparation de l'ADN, telles que l'effecteur du NHEJ XLF. Durant ces dernières décennies, de nombreuses études ont mis en lumière le rôle de différents facteurs impliqués dans la recombinaison V(D)J et la commutation isotypique de classe. Néanmoins, la composition précise des complexes de réponse aux CDBs induites par RAG et AID ainsi que leur régulation restent à déterminer. De plus, les facteurs nécessaires à la recombinaison V(D)J en l'absence d'ATM restent peu connus. Afin de répondre à ces questions, nous avons quantifié le protéome et le phosphoprotéome de lymphocytes B suite à l'induction de CDBs par RAG. Puis, afin d'identifier les protéines recrutées localement à ces cassures, nous avons utilisé une technologie de marquage de proximité appelée BioID pour cartographier l'interactome de XRCC4. Ces expériences de protéomique nous ont permis de détecter 220 protéines à la fois différentiellement phosphorylées et potentiellement recrutées aux cassures RAG, dont la plupart sont des candidats dont la fonction dans la recombinaison V(D)J n'est pas connue. Afin d'identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la recombinaison V(D)J, nous avons réalisé des criblages génétiques par CRISPR-Cas9 en utilisant une librairie de guides ARN ciblant les 220 facteurs identifiés dans nos données de protéomique ainsi que 1700 autres gènes associés à la réparation de l'ADN. Afin de détecter de potentielles protéines redondantes avec ATM au cours de ce processus, nous avons traité les cellules avec et sans inhibiteurs d'ATM (ATMi). Ces criblages génétiques nous ont permis de découvrir l'hélicase ADN/ARN Senataxine (SETX), enrichie spécifiquement en présence d'ATMi, phosphorylée et présente en proximité d'XRCC4 au cours de la V(D)J. Nous avons confirmé que SETX est nécessaire à la recombinaison V(D)J, agit de façon synergique avec ATM et XLF, et promeut la ligation des extrémités d'ADN adéquates au cours de ce processus. Nos criblages ont également révélé la déubiquitinase Usp7, dont nous avons également caractérisé la fonction. Enfin, nous avons appliqué les mêmes méthodes de protéomique dans une lignée cellulaire inductible pour la commutation isotypique de classe, afin d'identifier les voies de signalisation associées aux CDBs induites par AID. Nous avons identifié 202 facteurs différentiellement phosphorylés et présents en proximité de XRCC4 au cours de la CI, dont 178 représentent des candidats dont la fonction dans ce processus reste à déterminer. Dans leur ensemble, ces travaux permettent d'éclaircir les mécanismes qui régulent l'assemblage et la diversification des loci codant les immunoglobulines.