These Descartes

Les protéines de liaison à l'ARN, de la régulation des transcriptomes viraux à l'assemblage des virions

RNA binding proteins, from the regulation of viral transcriptomes to virion assembly

par Corentin AUBÉ sous la direction de Sarah GALLOIS-MONTBRUN
Thèse de doctorat en Infectiologie
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le mercredi 02 octobre 2024 à Université Paris Cité

Sujets

SARS-CoV-2 (virus)
Transcriptome
VIH (virus)
Virion

Un embargo est demandé par le doctorant jusqu'au 02 octobre 2025

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Mots clés	VIH-1, SARS-CoV-2, NanoViZer, RBP, Séquençage pleine longueur, Transcriptomique, Protéomique, Protéine Tat, Protéine G3BP, Bioinformatique
Resumé	En raison de leur taille de génome restreinte, les virus ont développé diverses stratégies pour maximiser leur diversité génétique via des mécanismes comme l'épissage alternatif (EA) ou la transcription discontinue (TD). Les protéines virales elles-mêmes peuvent avoir des fonctions multiples au cours du cycle de réplication. Parallèlement, les virus ont évolué pour détourner de nombreuses protéines cellulaires afin de soutenir leur réplication. Parmi elles, un grand nombre de RNA binding protéines (RBP) jouent un rôle essentiel à différentes étapes du cycle. Mon projet de thèse vise à étudier certaines RBP, virale ou cellulaire, qui participent aux destins des ARN viraux pendant l'infection du VIH-1 et du SARS-CoV-2. Mon projet s'articule autour de trois axes : 1-Caractériser la diversité des génomes et transcriptomes viraux en développant un outil bioinformatique d'analyse de séquençage pleine longueur : NanoViZer, 2-Caractériser le rôle inattendu de la protéine virale Tat dans la régulation de l'EA du VIH-1 et 3-Identifier des RBP cellulaires et caractériser les mécanismes participant à l'assemblage des virions du SARS-CoV-2. Le séquençage pleine longueur a révolutionné l'étude des transcriptomes mais les outils informatiques nécessitent des fichiers d'annotations des génomes et sont limités à l'étude de mécanismes spécifiques. Dans le cadre des virus, les fichiers d'annotations sont souvent incomplets voire manquants. Afin d'analyser l'architecture des génomes et transcriptomes viraux, sans à priori sur les mécanismes impliqués, nous avons développé NanoViZer, un outil rapide et simple d'utilisation qui ne nécessite aucun fichier d'annotation. Après avoir codé l'algorithme, j'ai validé cet outil sur des données issues de la littérature pour analyser le transcriptome du VIH-1, du VHS-1 et du SARS-CoV-2. Grâce à cet outil, j'ai révélé la présence de délétions dans les génomes du virus de l'hépatite D dans le sang circulant de patients. Dans la seconde partie de ma thèse, j'ai exploré un rôle nouveau de la protéine Tat du VIH-1 dans la régulation de l'EA. Lors de sa réplication, le VIH-1 génère plus de 50 ARNm par l'EA d'un ARN pre-messager unique. Un déséquilibre impactant la production de virions, ce processus est finement régulé. Trois études suggéraient un rôle de Tat dans l'EA mais son effet et les mécanismes impliqués étaient controversés. Grâce à un modèle viral dans lequel la transactivation de la transcription du VIH-1 est indépendante de Tat (VIH-VP16) et en tirant profit du séquençage pleine longueur et de NanoViZer, nous avons mis en évidence que Tat déstabilise l'ensemble du programme d'EA viral et favorise en particulier la production des ARNm de Tat, et par là l'expression de sa propre protéine. En explorant l'activité de plusieurs mutants de Tat, nous avons ensuite montré que l'activité de Tat dans l'EA est découplée de son activité transcriptionelle. Enfin, l'analyse de la réplication de ces différents mutants suggère que le rôle de Tat dans l'EA favorise la réplication du virus, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Enfin, en pleine période de pandémie COVID-19, je me suis intéressé aux RBP impliquées dans les étapes tardives de réplication du SARS-CoV-2. Pour cela, des virions de SARS-CoV-2 ont été isolés à partir deux lignées cellulaires pulmonaires infectées et analysés en spectrométrie de masse. Par analyses informatiques, j'ai déterminé 92 protéines cellulaires associées aux virions, dont de nombreuses RBP. En particulier, 27 protéines sont retrouvées dans des structures cytoplasmiques appelées granules de stress. De façon intéressante, les protéines G3BPs, protéines core des granules de stress, étaient particulièrement enrichies. En invalidant leur expression, nous avons révélé que les G3BPs interagissent avec la nucléoprotéine virale N et l'ARN du SARS-CoV-2, favorisent l'assemblage des virions du SARS-CoV-2 dans la cellule et la production de particules virales infectieuses.

Mots clés

VIH-1, SARS-CoV-2, NanoViZer, RBP, Séquençage pleine longueur, Transcriptomique, Protéomique, Protéine Tat, Protéine G3BP, Bioinformatique

Resumé

En raison de leur taille de génome restreinte, les virus ont développé diverses stratégies pour maximiser leur diversité génétique via des mécanismes comme l'épissage alternatif (EA) ou la transcription discontinue (TD). Les protéines virales elles-mêmes peuvent avoir des fonctions multiples au cours du cycle de réplication. Parallèlement, les virus ont évolué pour détourner de nombreuses protéines cellulaires afin de soutenir leur réplication. Parmi elles, un grand nombre de RNA binding protéines (RBP) jouent un rôle essentiel à différentes étapes du cycle. Mon projet de thèse vise à étudier certaines RBP, virale ou cellulaire, qui participent aux destins des ARN viraux pendant l'infection du VIH-1 et du SARS-CoV-2. Mon projet s'articule autour de trois axes : 1-Caractériser la diversité des génomes et transcriptomes viraux en développant un outil bioinformatique d'analyse de séquençage pleine longueur : NanoViZer, 2-Caractériser le rôle inattendu de la protéine virale Tat dans la régulation de l'EA du VIH-1 et 3-Identifier des RBP cellulaires et caractériser les mécanismes participant à l'assemblage des virions du SARS-CoV-2. Le séquençage pleine longueur a révolutionné l'étude des transcriptomes mais les outils informatiques nécessitent des fichiers d'annotations des génomes et sont limités à l'étude de mécanismes spécifiques. Dans le cadre des virus, les fichiers d'annotations sont souvent incomplets voire manquants. Afin d'analyser l'architecture des génomes et transcriptomes viraux, sans à priori sur les mécanismes impliqués, nous avons développé NanoViZer, un outil rapide et simple d'utilisation qui ne nécessite aucun fichier d'annotation. Après avoir codé l'algorithme, j'ai validé cet outil sur des données issues de la littérature pour analyser le transcriptome du VIH-1, du VHS-1 et du SARS-CoV-2. Grâce à cet outil, j'ai révélé la présence de délétions dans les génomes du virus de l'hépatite D dans le sang circulant de patients. Dans la seconde partie de ma thèse, j'ai exploré un rôle nouveau de la protéine Tat du VIH-1 dans la régulation de l'EA. Lors de sa réplication, le VIH-1 génère plus de 50 ARNm par l'EA d'un ARN pre-messager unique. Un déséquilibre impactant la production de virions, ce processus est finement régulé. Trois études suggéraient un rôle de Tat dans l'EA mais son effet et les mécanismes impliqués étaient controversés. Grâce à un modèle viral dans lequel la transactivation de la transcription du VIH-1 est indépendante de Tat (VIH-VP16) et en tirant profit du séquençage pleine longueur et de NanoViZer, nous avons mis en évidence que Tat déstabilise l'ensemble du programme d'EA viral et favorise en particulier la production des ARNm de Tat, et par là l'expression de sa propre protéine. En explorant l'activité de plusieurs mutants de Tat, nous avons ensuite montré que l'activité de Tat dans l'EA est découplée de son activité transcriptionelle. Enfin, l'analyse de la réplication de ces différents mutants suggère que le rôle de Tat dans l'EA favorise la réplication du virus, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Enfin, en pleine période de pandémie COVID-19, je me suis intéressé aux RBP impliquées dans les étapes tardives de réplication du SARS-CoV-2. Pour cela, des virions de SARS-CoV-2 ont été isolés à partir deux lignées cellulaires pulmonaires infectées et analysés en spectrométrie de masse. Par analyses informatiques, j'ai déterminé 92 protéines cellulaires associées aux virions, dont de nombreuses RBP. En particulier, 27 protéines sont retrouvées dans des structures cytoplasmiques appelées granules de stress. De façon intéressante, les protéines G3BPs, protéines core des granules de stress, étaient particulièrement enrichies. En invalidant leur expression, nous avons révélé que les G3BPs interagissent avec la nucléoprotéine virale N et l'ARN du SARS-CoV-2, favorisent l'assemblage des virions du SARS-CoV-2 dans la cellule et la production de particules virales infectieuses.