Syndrome de Waardenburg, Crête neurale, Perte auditive, Maladie génétique rare, Identification des gènes

Le syndrome de Waardenburg (SW) est une maladie rare caractérisée par une surdité et des altérations pigmentaires des cheveux, de l'iris et de la peau, dues à un défaut du développement de la crête neurale (CN). Ce syndrome est divisé en quatre types sur la base du phénotype. Bien que le plus simple d'un point de vue clinique, le SW de type 2 (SW2) est le moins bien compris, avec seulement la moitié des cas expliqués au niveau moléculaire. Dans le but d'identifier de nouveaux gènes, nous avons procédé au séquençage de l'exome entier d'une cohorte de 16 patients atteints de WS2 sans explication moléculaire. J'ai ainsi trouvé 3 patients porteurs de variants hétérozygotes, rares et prédits pathogènes dans ADAMTS20, un gène codant une enzyme qui clive le versican (VCAN) au niveau de la matrice extracellulaire et impliquée dans le développement des mélanocytes. Le séquençage ciblé d'ADAMTS20 chez 8 autres patients nous a ensuite permis d'identifier un quatrième variant dans ce gène. Une analyse familiale approfondie de ces cas d'ADAMTS20 a montré une coségrégation du variant et de la maladie dans deux familles (hérédité dominante) et une interprétation qui semblait plus complexe en première approche dans les deux autres. Afin d'éliminer les réarrangements génomiques et les variants non codants autour des gènes WS connus, un séquençage du génome entier en trios a été réalisé pour ces 4 cas et pour 4 autres cas pour lesquels aucun gène candidat n'avait été identifié. C'est ainsi que j'ai identifié et publié un réarrangement de novo de SOX10 en mosaïque chez l'un des patients, qui explique très probablement le phénotype. Ce patient portait un variant d'ADAMTS20 mais l'étude de ségrégation ne semblait pas cohérente avec l'histoire familiale. J'ai ensuite réalisé des tests fonctionnels pour évaluer la perte de fonction des trois variants d'ADAMTS20 restants. En utilisant plusieurs modèles cellulaires (hTERT RPE-1 ; NIH-3T3 ; HEK 293T ; B16-F10), j'ai analysé l'expression et la localisation subcellulare d'ADAMTS20 ainsi que les modifications de la forme cellulaire et nucléaire. Parallèlement, j'ai testé par western blot le clivage du VCAN, la cible principale de l'enzyme ADAMTS20. Pour évaluer les variantes d'ADAMTS20 dans un modèle in vivo, je me suis concentré sur la souris et le xénope. Nous avons caractérisé la dépigmentation et la capacité auditive du modèle murin Adamts20 (belted) avec la mutation homozygote p.Gln665*. En collaboration avec le Dr. Grant Wheeler, nous avons réalisé un knock-out CRISPR-cas9 du gène pour observer le phénotype résultant et injecté de l'ARNm contenant soit la forme sauvage soit les variants d'Adamts20, afin d'analyser le sauvetage phénotypique du knock-out. Un deuxième objectif de mon travail était d'utiliser des protocoles de différenciation CN de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) pour mettre en place une analyse fonctionnelle des mutations de SOX10, avec une application future possible à de nouveaux gènes de WS. Trois lignées iPSC provenant de patients porteurs de mutations SOX10 ont été générées. Le potentiel de différenciation cellulaire à différents moments a été analysé par RTqPCR et immunocytochimie, ouvrant la voie à de futures études de corrélation génotype-phénotype. Dans l'ensemble, mon projet de doctorat a permis d'identifier et d'étudier un gène candidat et une voie de développement qui peuvent être liés à des cas non résolus de WS2, et aidera à transférer les connaissances aux familles par le biais du conseil génétique.