TCR, Signalisation, APEX2, Signalisation endosomale, IRAP, Protéomique, Lymphocyte T

Les plateformes de signalisations cellulaires ont souvent été associées à une signalisation membranaire et étudiées sous ce prisme. Cela a été particulièrement le cas dans le cadre du récepteur à l'antigène du lymphocyte T (TCR). Toutefois, de plus en plus d'études mettent en avant un possible rôle de la signalisation endosomale dans les lymphocytes T. Étudier cette potentielle nouvelle voie de signalisation pourrait nous permettre d'agir plus finement sur la manipulation des réponses lymphocytaires T. Pour étudier cette hypothèse de la signalisation endosomale du TCR, nous avons choisi d'étudier la chaîne CD3z, qui est la chaîne du complexe TCR avec le plus grand potentiel de transduction du signal, portant 6 motifs ITAM. Nous avons pu mettre en évidence que la chaine CD3z est localisée dans un compartiment endosomal marqué par la SNARE Syntaxine 6 et par la protéine IRAP (Insulin Responsive AminoPeptidase). Au cours de la synapse immunologique (SI), ce pool endosomal de chaîne CD3z est transporté vers la SI. En plus d'être un réservoir mobilisable de la chaîne CD3z, nous avons démontré que ces endosomes sont aussi une plateforme de signalisation intracellulaire. Nous avons ensuite démontré que la délétion d'IRAP menait à une diminution de la phosphorylation de protéines impliquées dans la signalisation du TCR et à une production diminuée de l'IL-2 par les lymphocytes T. Ces défauts d'activation des lymphocytes T déficientes pour IRAP sont dus à une diminution de la signalisation du TCR à partir des endosomes, comme démontré par des expériences de FRET et Duolink. Finalement, nous avons montré que cette plateforme de signalisation dépendante d'IRAP était importante pour la survie des lymphocytes T en périphéries chez la souris et pour l'efficacité de la réponse T anti-tumorale. Nous nous sommes ensuite intéressés à la composition de ces plateformes endosomales de signalisation du TCR. Afin d'en comprendre leur composition, nous avons décidé d'utiliser la méthode de biotinylation in situ à l'aide de l'enzyme APEX2, en fusion avec la chaîne CD3z. APEX2 biotinyle les protéines situées dans un rayon de 20 nm autour de la chaîne CD3z. Nous avons choisi cette méthode, qui, par différence des co-immunoprécipitations utilisées habituellement, peut identifier pas seulement les interactions protéiques résistantes aux détergents, mais aussi les interactions de faible affinité qui ont lieu in situ, avant la lyse cellulaire. Nous avons couplé la biotinylation à une cinétique d'activation des lymphocytes T sur des temps relativement longs (jusqu'à 60 minutes). La mise en place de cette technique nous a permis de récupérer plus de 200 protéines situées en proximité de la chaîne CD3z. Nous avons pu étudier leur variation au cours de la cinétique. Nous avons pu montrer que ZAP-70 était la protéine de signalisation qui subissait l'augmentation la plus forte après activation et que d'autres protéines bien connues, comme LCK, Nck1, ITK or Fyn étaient constitutivement présentes dans l'environnement du TCR. Cette analyse a aussi montré plusieurs nouvelles protéines qui n'avaient pas été impliquées auparavant dans la signalisation du TCR, telles que les kinases STK10, Mink1, MAP4K4, TTK et ILK. Nous avons validé l'implication des kinases ILK et TTK dans la signalisation du TCR, et notamment leur rôle dans le contrôle de la phosphorylation de CD3z, ZAP70, LAT et PLCg1, ainsi que dans la sécrétion d'IL-2. Ces validations montrent que cette technique permet de récupérer des protéines impliquées dans la signalisation des lymphocytes T. L'étude de la signalisation endosomale à l'aide de cette nouvelle méthode de biotinylation in situ pourrait permettre de progresser dans la compréhension de la signalisation du TCR. Ces nouvelles connaissances théoriques pourraient conduire à des nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment dans le cadre des nouvelles thérapies cellulaires utilisant les « CAR-T cells ».