Cutting-edge high-resolution mass spectrometry approaches for the analysis of biotherapeutics and their biotransformations
Développement d'approches innovantes de spectrométrie de masse à haute résolution pour l'analyse de biomédicaments et de leurs biotransformations
par Jonathan DHENIN sous la direction de Julia CHAMOT-ROOKE
Thèse de doctorat en Immunologie
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le vendredi 21 avril 2023 à Université Paris Cité

Sujets
  • Biotransformation (métabolisme)
  • Chromatographie en phase liquide
  • Immunocapture
  • Pharmacocinétique
  • Protéomique
  • Spectrométrie de masse
La thèse est confidentielle jusqu’au 21 avril 2033. Pendant la durée de confidentialité, le texte intégral ne peut être consulté. 
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Mots clés
Spectrométrie de masse, Chromatographie liquide, Protéomique top-down, Anticorps thérapeutiques, Protéines de fusion, Immunocapture, Biotransformation, Pharmacocinétique
Resumé
Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes d'analyse protéomique « top-down » et « middle-down » par LC-MS/MS (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse) pour la caractérisation d'anticorps, de protéines de fusion et de leurs produits de biotransformation. L'ensemble des travaux de recherche a été réalisé en collaboration entre l'Institut Pasteur et Sanofi. Dans un premier temps, l'évaluation de différents paramètres expérimentaux (énergie en source, pression dans l'IRM, type de fragmentation, état de charge des ions précurseurs) a été réalisée pour optimiser les méthodes d'analyse par spectrométrie de masse Orbitrap de ces molécules dans leurs solutions d'administration. Deux spectromètres de masse différents ont été utilisés pour ces études : un spectromètre de masse Exploris 480 et un spectromètre de masse Tribrid Eclipse (équipé d'ETD, d'UVPD et du PTCR). Les méthodes développées ont ensuite été transposées et adaptées à l'analyse de biomédicaments présents en faible concentration dans des échantillons biologiques d'intérêt. Une attention particulière a été apportée à l'automatisation de la préparation d'échantillon reposant sur une immunocapture à partir de très faibles volumes de plasma et à l'amélioration de la sensibilité de l'analyse. Les deux spectromètres de masse ont été comparés en termes de sensibilité et de linéarité. Les avantages et les limitations de chacune des stratégies utilisées (middle-down, top-down) ont ensuite été évalués pour la caractérisation la plus complète possible d'un anticorps monoclonal thérapeutique (pembrolizumab) purifié à partir de plasma de souris. De multiples protéoformes de l'anticorps monoclonal ont pu être suivies avec précision, même à très faible concentration dans le plasma. Enfin, la complémentarité de ces approches a été mise à profit pour caractériser des produits de biotransformation peu abondants de deux protéines de fusion multi-spécifiques de 150 et 200 kDa administrées lors d'études pharmacocinétiques chez la souris.