Oxoglutarate déshydrogénase, Métabolisme central, Cristallographie aux rayons X, Analyse de la particule isolée, Cryo-ME, Biophysique des protéines

Cette thèse de doctorat fait partie d'un projet plus large qui vise à décortiquer la plasticité métabolique des Actinobactéries, un phylum de plus importants parmi les procaryotes et qui inclut des pathogènes importants comme Mycobacterium tuberculosis, en même temps que des espèces d'intérêt industriel comme Corynebacterium glutamicum. Le projet examine la régulation des noeuds du pyruvate et de l'oxoglutarate, au croisement du métabolisme du carbone et de l'azote, et utilise C. glutamicum comme modèle de travail. Mon travail de thèse a été focalisé sur la caractérisation structurale et biochimique d'un supercomplexe mixte incluant la pyruvate déshydrogénase (PDH) et la 2-oxoglutarate déshydrogénase (ODH), initialement identifié chez C. glutamicum. Une approche de biologie structurale intégrative a donc été suivie afin de disséquer la structure tridimensionnelle des protéines dans ce supercomplexe, comment elles interagissent et sont régulées. La première partie de cette thèse est consacrée à l'étude structurale de la 2-oxoglutarate déshydrogénase OdhA, un grand enzyme de plus de 1200 résidus issu de la fusion de deux domaines, normalement localisés sur des enzymes séparés, chacun apportant une activité distincte. La structure, résolue par analyse des particules isolées par cryo-microscopie électronique (cryo-ME) et par cristallographie aux rayons X, montre que l'enzyme est structuré comme un trimère de dimères, une architecture homohéxamérique jusqu'à présent jamais observée pour cette famille d'enzymes. Différents complexes d'OdhA, avec substrats ou régulateurs allostériques, ont été résolus par analyse des particules isolées par cryo-ME, tous à des résolutions entre 2.2 et 2.3 Å, permettant de montrer qu'OdhA passe par un changement conformationnel pour aller d'un état de repos à un état activé. J'ai pu aussi montrer, par une structure cryo-ME à haute résolution du complexe OdhA-OdhI, qu'OdhI, une petite protéine à domaine FHA, agit en tant qu'inhibiteur allostérique de OdhA en empêchant ce changement conformationnel. Ces résultats sont en accord avec les travaux antérieurs du laboratoire sur les protéines correspondantes de Mycobacterium smegmatis, une espèce modèle pour M. tuberculosis. La deuxième partie de ma thèse est consacrée à l'analyse des interactions protéine-protéines au sein du supercomplexe. Pour cela, en collaboration avec la Plateforme de Biophysique Moléculaire de l'Institut Pasteur, j'ai utilisé nombre de techniques biophysiques, de la résonance plasmonique de surface (SPR) à la photométrie de masse, à l'ultracentrifugation analytique et la diffusion de lumière multi-angle couplée à la chromatographie par exclusion stérique (SEC-MALLS). Les résultats nous fournissent une vue d'ensemble des interactions protéine-protéine principales à l'intérieur du supercomplexe PDH/ODH. En outre, j'ai obtenu deux structures cristallographiques de composants du supercomplexe associés à des peptides de leur partenaires d'interactions, c'est à dire la structure cristallographique du cœur trimerique de AceF (dihydrolipoyl acetyltransférase) en complexe avec le peptide N-terminale de OdhA, et la structure cristallographique de la Lpd (dihydrolipoyl déshydrogénase) en complexe avec le domaine périphérique de liaison aux sous-unités (PSBD) de AceF. La dernière partie de cette thèse décrit la coexpression et purification chez Escherichia coli des quatre composants du supercomplexe PDH/ODH de C. glutamicum, et la caractérisation préliminaire du complexe purifié. Je conclue en discutant les implications de notre travail pour la compréhension de la régulation du métabolisme central chez les Actinobactéries, comment nos résultats défient des vieux 'dogmes' et posent une nouvelle lumière sur l'évolution de complexes du type 2-oxoacides déshydrogénase, et les perspectives du projet et du domaine.