Pseudopilus assembly and substrate recognition factors in the Klebsiella type II secretion system
Facteurs impliqués dans l'assemblage du pseudopilus et dans la reconnaissance du substrat dans le système de sécrétion de type II chez Klebsiella
par Yuanyuan LI sous la direction de Olivera FRANCETIC
Thèse de doctorat en Microbiologie
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le vendredi 16 décembre 2022 à Université Paris Cité

Sujets
  • Amylases
  • Bactéries Gram négatives
  • Klebsiella
  • Systèmes de sécrétion de type II

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Mots clés
Système de sécrétion de type II, Assemblage des piili, Interaction protéine-protéine, Signal de sécrétion, Klebsiella
Resumé
Les bactéries à Gram-négatif utilisent plusieurs mécanismes pour sécréter des protéines spécifiques à travers leur enveloppe vers la surface cellulaire ou le milieu. Chez Klebsiella, notre modèle expérimental, le système de sécrétion de Type II (SST2) permet la sécrétion de la pullulanase (PulA), une enzyme de la famille des amylases. La sécrétion de PulA repose sur l'assemblage de filaments périplasmiques appelés pseudopili qui facilitent le transport des substrats repliés du périplasme à travers la membrane externe. Les pseudopili, apparentés aux pili de type IV, sont composés de quatre sous-unités mineures (PulHIJK) et d'une sous-unité majeure, PulG. Ils sont polymérisés dans la membrane interne au niveau d'un sous-complexe de SST2 - la plateforme d'assemblage - composé de protéines PulF, PulL et PulM. Le mécanisme d'assemblage du pseudopilus et son rôle éventuel dans la reconnaissance du substrat restent mal compris. PulA est une lipoprotéine de 117 kDa sécrétée par le SST2 sous forme repliée. Dans ce travail, nous avons cherché à identifier les composants du SST2 qui interagissent directement avec PulA pour permettre sa sécrétion. Dans ce but, nous avons effectué une analyse systématique par l'approche du double hybride bactérien (BACTH), ainsi que par pontage chimique et co-purification. Nous avons également mis en place une approche de pontage in vivo après irradiation aux rayons UV grâce à l'acide aminé non naturel pBPA introduit dans les régions de PulA contenant des signaux de sécrétion potentiels. L'analyse par BACTH a identifié les composants de la plate-forme d'assemblage PulF et PulM, ainsi que les pseudopilines PulG, PulI et PulH, comme partenaires d'interaction putatifs de PulA. Dans la deuxième partie du travail, nous nous sommes intéressés aux composants de la plateforme d'assemblage PulL et PulM impliqués dans l'assemblage des pseudopili et dans la sécrétion de PulA. Ce travail a été réalisé en collaboration avec l'équipe de N. Izadi-Pruneyre, qui a déterminé la structure des domaines C-terminaux (CTD) de PulL et PulM et de leur interface dans le complexe. Nous avons construit des variants contenant des substitutions des résidus d'interface PulLCTD - PulMCTD et montré qu'ils sont déficients pour la sécrétion de PulA. Nous avons également étudié les interactions PulL - PulM par l'approche du BACTH et utilisé le pontage disulfure pour caractériser les interactions entre leurs segments transmembranaires. Ensemble, ces données nous ont permis de proposer un modèle structural du complexe PulL - PulM dans la membrane. Nos travaux ont révélé un ratio entre PulM et PulL dans la cellule de 20 :1 ce qui suggère un rôle dynamique de PulM dans le transfert de PulG, entre les molécules de PulG libre et celles de PulL associées au site actif d'assemblage du pseudopilus. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle des hélices périplasmiques et des domaines cytoplasmiques de PulL et PulM dans leur assemblage. Nous avons constaté que la super-hélice formée entre leurs domaines périplasmiques joue un rôle clé dans la liaison PulL-PulM. Nous avons également constaté que le peptide N-terminal de PulM est nécessaire à la stabilité de PulL. Le même peptide interagit avec PulG, suggérant son rôle dans l'échange dynamique avec le domaine cytoplasmique de PulL. Ces résultats ouvrent la voie à des études plus détaillées sur des interactions et changements conformationnels impliqués dans les différentes étapes de l'extraction membranaire et incorporation de PulG dans le pseudopilus.