Mt1, Cb1, Hétéromère, Mitochondries, Membrane plasmique

Les récepteurs membranaires appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) forment la plus grande famille de protéines du génome humain avec plus de 800 membres. Jusqu'à récemment, le mode d'action considéré pour ces RCPGs était que des monomères présents à la membrane plasmique permettaient la transduction du signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur après activation par leur ligand respectif. Les résultats ont montré que des récepteurs différents peuvent s'associer pour former des complexes avec de nouvelles propriétés et que des récepteurs fonctionnels sont aussi retrouvés au niveau d'organites intracellulaires. Les mitochondries font partie des organites dans lesquels des RCPGs fonctionnels ont été identifiés. Récemment, le récepteur de la mélatonine de type 1 (MT1) et le récepteur des cannabinoïdes de type 1 (CB1) ont été retrouvés au niveau des mitochondries neuronales. Mon projet de thèse concerne l'identification de l'hétéromère MT1/CB1, sa caractérisation ainsi que les fonctions cellulaires corégulées par les récepteurs MT1 et CB1. J'ai montré l'existence de l'hétéromère MT1/CB1 par plusieurs approches expérimentales. L'analyse par microscopie confocale d'expériences d'immunofluorescence m'a permis d'identifier une colocalisation importante des récepteurs MT1 et CB1 dans des cellules transfectées. Des expériences de coimmunoprécipitation réalisées in vitro sur des cellules transfectées HEK293T ou HeLa et in vivo sur des extraits de cervelets de souris sauvages ou invalidées pour les récepteurs MT1 ou CB1 ont montré une interaction physique entre les deux récepteurs. La proximité moléculaire entre les récepteurs MT1 et CB1 a été mise en évidence par la technique de complémentation utilisant l'enzyme Nanoluciférase et par la technique de "Proximity Ligation Assay" (PLA). La spécificité des signaux PLA a été vérifiée grâce à des peptides interférants, les signaux n'étant plus détectés lorsque les cellules avaient été traitées par eux, Des expériences de microscopie électronique (EM) et PLA réalisées sur des cellules HEK293T transfectées et non-perméabilisées indiquent la présence des hétéromères MT1/CB1 à la surface des cellules en absence de ligand. Nous avons aussi pu suivre en temps réel l'internalisation des hétéromères MT1/CB1 grâce à une approche combinant la complémentation (Nanoluciférase) et la méthode de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer). L'incubation avec la mélatonine induit l'internalisation des hétéromères et leur passage par les compartiments endosomaux précoces et tardifs des cellules HEK293T. De plus, il a été possible d'observer, par une combinaison d'expériences de PLA et d'immunofluorescence, une colocalisation des signaux de PLA avec le réseau mitochondrial, résultat suggérant que les hétéromères MT1/CB1 sont dans ou associés aux mitochondries en absence de ligand. La respiration mitochondriale a été mesurée sur des préparations de mitochondries semi-purifiées à partir de cellules HEK293T transfectées avec les deux récepteurs et à partir de cervelets de souris sauvages ou invalidées pour les récepteurs MT1 ou CB1. Un effet synergique sur la respiration motonchondriale a été observé lorsque les deux récepteurs sont activés. Ces résultats décrivent l'existence d'un dialogue entre les récepteurs de la mélatonine de type 1 et le récepteur des cannabinoïdes de type 1 par hétéromérisation. La présence des hétéromères à la surface des cellules et au niveau des mitochondries permet d'envisager de nouveaux de traitements thérapeutiques dans le futur.