Study of the lysosomal trafficking of cystinosin and its role in the mTORC1 pathway
Pas de titre en français
par Andrzejewska Zuzanna sous la direction de Antignac Corinne
Thèse de doctorat en Génétique
École doctorale Génétique, Cellulaire, Immunologie, Infectiologie et Développement

Soutenue le Friday 29 November 2013 à Université Paris Descartes ( Paris 5 )

Sujets
  • Cystinose
  • Maladies héréditaires
  • Maladies neurologiques de surcharge lysosomiale
  • Physiopathologie
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Mots clés
Génétique
Resumé
La cystinose (MIM 21980) est une maladie de surcharge lysosomale héréditaire rare caractérisée par un efflux défectueux de cystine hors des lysosomes. Le gène impliqué dans la cystinose code pour une protéine transmembranaire lysosomale, la cystinosine, qui fonctionne comme un co-transporteur de cystine et de protons. De plus, la cystinosine, possède deux motifs d'adressage aux endosomes tardifs et aux lysosomes: un classique, le motif GYDQL dans sa partie C-terminale, et un nouveau signal conformationnel dans la boucle située entre les 5ème et 6ème domains transmembranaires. La première partie de mon projet de thèse vise à caractériser le trafic intracellulaire de la cystinosine. L'adressage des protéines de la membrane lysosomale à ces organelles peut se faire par deux voies, la voie directe (intracellulaire) et la voie indirecte (via la membrane plasmique), médiées par les complexes AP (AP- 1 à AP -4 et probablement récemment décrit AP- 5). Grâce à l'utilisation de la technique du double hybride, nous avons identifié une forte interaction entre le motif GYDQL et la sous-unité μ3 du complexe AP3. Par ailleurs, nous avons montré que la déplétion d'AP-3 dans des cellules HeLa conduit à une augmentation de localisation de la cystinosine-GFP à la membrane plasmique ainsi que à la rétention de la protéine chimère, proteine CD63 dont le signal d'adressage a été remplace par celui de la cystinosine (CD63-Cter-GFP), dans l'appareil de Golgi. Ces résultats confirment l'importance de la voie directe AP-3-dépendante dans l'adressage de la cystinosine au lysosome. La deuxième partie de mon projet a consisté à caractériser un éventuel nouveau rôle de la cystinosine. Grâce à une approche de protéomique, nous avons montré que la cystinosine interagissait avec divers membres de la voie mTORC1: les Rag GTPases RagA et RagC, les composantes du complexe Ragulator et la v -ATPase, pompe à protons couplant l'hydrolyse de l'ATP avec le transport de protons. Lors de la stimulation par des acides aminés, l'hétérodimère actif de Rag GTPases et le complexe pentamérique Ragulator recrutent mTORC1 à la surface des lysosomes, à proximité de son activateur Rheb, déclenchant la cascade de signalisation. En outre, il a été récemment montré que l'interaction, dépendante des acides aminés, entre la v-ATPase et le complexe Ragulator-Rag est nécessaire pour l'activation de mTORC1. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que la cystinosine et la v-ATPase pourraient fonctionner ensemble dans un mécanisme lysosomal de détection d'acides aminés appelé "inside-out". En effet, nous avons montré que l'absence de cystinosine a un impact à la fois sur le recrutement de mTORC1 aux lysosomes et sur le positionnement de ces organelles en réponse à la déprivation puis à l'ajout des acides aminés, ce qui démontre le double rôle de ce transporteur d'acides aminés. Ce rôle nouvellement décrit de la cystinosine pourrait aider à mieux comprendre la physiopathologie de la cystinose, conduisant ainsi à l'amélioration des traitements existants.