Etude de l'attachement et de l'entrée du virus LIoviu (LLOV) à la cellule hôte et exploration du virome de carnivores de la faune française
Study of the attachment and entry of Lloviu virus (LLOV) to and in the host cell and exploration of the virome of carnivores from French wildlife
par Azdeen GOLAMAULLY sous la direction de Jean-Claude MANUGUERRA
Thèse de doctorat en Microbiologie
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le jeudi 19 décembre 2019 à Université de Paris (2019-....)

Sujets
  • Filoviridés
  • Genette commune
  • Picornaviridés
  • Putois
  • Virus Ebola
  • Visons
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Mots clés
Virus Lloviu, Kobuvirus, TIM-I
Resumé
La famille des Filoviridae comprend trois genres : Ebolavirus, Marburgvirus, et Cuevavirus. Le pouvoir pathogène des filovirus chez l'homme varie entre les différents genres de filovirus, et entre différentes espèces d'un même genre. Ainsi, il n'y a pas de données en faveur d'un pouvoir pathogène d'Ebola Reston chez l'homme, ni des Cuevavirus (genre récemment créé en 2012 suite à la découverte du virus Lloviu). Nous avons étudié l'entrée du virus Lloviu dans différentes cellules cibles. Dans la mesure où il n'y a aucun isolat de ce virus, nous avons utilisé un système de pseudo-particules filovirales, développé par Thomas Hoenen et Heinz Feldmann (NIAID-NIH, USA), basé sur un minigenome tétracistronique, contenant les gènes GP, VP40 et VP24 d'Ebolavirus Mayinga (variant de l'épidémie de 1976), et le gène rapporteur luciférase, ainsi que des vecteurs d'expression pour les protéines VP30, VP35, NP et L d'Ebolavirus Mayinga. Ce système permet de produire des VLP filovirales de morphologie bona fide qui ont été décrites comme étant jusqu'à 500 fois plus infectieuses ex vivo que des VLPs produites par surexpression de VP40 et GP. Il permet d'étudier l'ensemble du cycle viral et de générer d'autres VLP à chaque passage. La production de VLP filovirales portant la GP d'Ebolavirus Mayinga donne des niveaux de production de VLP infectieuses dans les cellules HEK 293T (quantification de l'activité luciférase dans les cellules cibles P1 jusqu'à P3) comparables à ceux obtenus par les auteurs décrivant ce système (Watt et al. 2014). En remplaçant la GP du virus Ebola Mayinga par la GP du Cuevavirus prototype Lloviu virus (filovirus retrouvé uniquement chez la chauve-souris Miniopterus schreibersii dont la GP présente 34% d'homologie en acides aminés avec la GP du virus Ebola Mayinga), nous avons mis en place un système hétérologue donnant des niveaux de production de VLP infectieuses dans les cellules HEK 293T comparable au système initial. Ce système utilise le récepteur TIM-1 (T cell immunoglobulin mucin I), connu pour favoriser l'entrée du virus Ebola dans ces cellules cibles. Nous avons cherché à tester le rôle de ce récepteur pour l'entrée des pseudo-particules filovirales porteuses de la GP du virus Lloviu, dans des cellules cibles HEK 293T et VERO E6. Les résultats suggèrent que l'expression de TIM-1 dans les cellules cibles HEK 293T améliore l'entrée des pseudo-particules filovirales porteuses de la GP du virus Lloviu, contrairement aux cellules cibles VERO E6. Nous avons alors cherché, par homologie de séquences avec des mutations connues pour avoir un effet délétère sur l'entrée du virus Ebola, à identifier les résidus importants sur la GP du virus Lloviu pour son interaction avec le récepteur TIM-1. Les résultats montrent que certaines de ces mutations auraient aussi un effet délétère sur l'entrée des pseudo-particules filovirales porteuses de la GP du virus Lloviu. Le virus Lloviu est le premier filovirus découvert en Europe, et ce uniquement chez les chauves-souris Miniopterus schreibersii. Nous avons cherché, par des méthodes spécifiques de biologie moléculaire, la présence de filovirus dans différents échantillons de petits carnivores de la faune sauvage du Sud-Ouest de la France, notamment des putois, la forme sauvage des furets, eux-mêmes utilisés comme modèles animaux pour l'étude in vivo d'infection aux filovirus. Nous n'avons pas détecté de génome de filovirus. Nous avons exploré par séquençage haut débit (NGS) le virome de ces putois. Nous avons confirmé l'absence de génome de filovirus dans ces échantillons provenant de putois, mais nous avons détecté la présence de génome de kobuvirus. Afin d'obtenir la totalité du génome de ce virus, un séquençage par la méthode SANGER, et par la technologie MinION a été entrepris. Nous avons pu ainsi séquencer environ 80% du génome du kobuvirus.