Interplay between influenza viruses and the cellular splicing machinery
Interaction entre les virus influenza et la machinerie d'épissage cellulaire
par Usama ASHRAF sous la direction de Nadia NAFFAKH
Thèse de doctorat en Infectiologie
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le mercredi 20 novembre 2019 à Université Paris Cité

Sujets
  • Épissage des ARN
  • Épissage (génétique)
  • Influenzavirus A
  • Séquençage des acides nucléiques
  • Séquençage nucléotidique à haut débit
  • Virus à ARN
  • Virus à ARN
  • Virus de la grippe A
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Mots clés
Immunothérapie adoptive, RED-SMU1
Resumé
A la différence de la plupart des virus à génome ARN, les virus influenza se répliquent dans le noyau des cellules infectées, et ont développé une expansion de la capacité de codage de leur génome par le biais de l'épissage de certains de leurs ARN messager (ARNm). Pour les virus influenza de type A (IAV), il a été montré que des interactions physiques et fonctionnelles entre des protéines virales et des facteurs d'épissage cellulaire régulent étroitement l'épissage des ARNm viraux, et sont essentielles à la réplication virale. Une analyse plus poussée des interactions entre IAV et épissage cellulaire devrait contribuer à une meilleure connaissance des mécanismes de régulation de l'expression des gènes viraux, et du réseau complexe des interactions entre virus influenza et cellule hôte. Elle pourrait également conduire à l'élaboration de nouvelles thérapies thérapeutiques permettant de surmonter la principale limitation des antiviraux actuellement disponibles, à savoir l'émergence rapide et fréquente de virus pharmacorésistants.Dans ce cadre nous nous sommes fixé deux objectifs: (i) explorer le potentiel de molécules déstabilisatrices du complexe d'épissage RED-SMU1 humain pour le traitement des infections grippales; et (ii) caractériser, à l'échelle du transcriptome, les altérations des évènements d'épissage cellulaire induites par l'infection grippale. Sur la base de données antérieures démontrant que le complexe d'épissage RED-SMU1 est essentiel à l'épissage de l'ARNm NS1 des IAV et à la multiplication virale, nous avons cherché à identifier des composés capables de déstabiliser le complexe RED-SMU1, et par conséquent d'inhiber la réplication des IAV. À cette fin, nous avons collaboré avec des experts en biologie structurale (T. Crépin, IBS Grenoble), et en modélisation moléculaire et chimie médicinale (N. Pietrancosta, Université Paris Descartes). Nous avons commencé par confirmer expérimentalement les données de structure cristalline tridimensionelle d'un complexe RED-SMU1 minimal, composé du domaine N-terminal de SMU1 (acides aminés 1 à 196) et d'un court domaine médian de RED (acides aminés 206 à 260). Pour ce faire nous avons combiné un test d'interaction RED-SMU1 en cellules 293T, basé sur la trans-complémentation de deux sous-domaine de la luciférase de Gaussia princeps (« split-luciferase ») fusionnés l'un à RED et l'autre à SMU1, avec de la mutagenèse dirigée. Puis la structure du complexe RED-SMU1 minimal a servi de base criblage in silico d'une chimiothèque de 4121 composés, à la recherche de molécules capable de rentrer en compétition avec RED pour la liaison à SMU1. A l'issue d'un premier criblage, nous avons procédé à l'évaluation expérimentale de 16 molécules sélectionnées in silico. Leur toxicité, leur capacité à réduire le signal d'interaction RED-SMU1 dans le test de trans-complémentation « split-luciferase », et leur capacité à inhiber la réplication d'un IAV recombinant porteur d'un gène rapporteur Nanoluc, ont été déterminées. Parmi les 3 composés présentant les meilleures performances, le composé LSP641 a été co-cristallisé avec le domaine N-terminal de SMU1 par notre collaborateur T. Crépin.