Les bases moléculaires de la thermogenèse induite par la protéine découplante UCP1
Molecular bases of mitochondrial uncoupling protein 1 induced thermogenesis
par Mathilde PIEL sous la direction de Bruno MIROUX
Thèse de doctorat en Biologie moléculaire
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le vendredi 27 septembre 2019 à Université Paris Cité

Sujets
  • biosynthèse
  • Mutagenèse
  • Protéines membranaires
  • Respiration cellulaire
  • Saccharomyces cerevisiae
  • Spectroscopie de masse
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Mots clés
Β-lactoglobuline, UCP1, S. cerevisiae, Photomarquage
Resumé
La protéine découplante UCP1 est localisée dans la membrane interne des mitochondries du tissu adipeux brun. Elle fait partie de la famille des transporteurs mitochondriaux (SLC25). En présence d'acide gras à chaîne longue, UCP1 permet le passage des protons de l'espace intermembranaire vers la matrice, découplant ainsi la chaîne respiratoire de la production d'ATP. Ceci provoque un emballement de l'oxydation des substrats dans la mitochondrie et mène à la production de chaleur. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer la conductance aux protons provoquée par l'ajout d'acides gras sur UCP1 mais la localisation précise du site de fixation des acides gras reste inconnue. Plusieurs modèles structuraux d'UCP1 et UCP2 ont été obtenus par RMN en présence de dodécylphosphocholine (DPC) et deux résidus, K56 et K269, ont été proposés comme étant cruciaux pour la fixation des acides gras et l'activation d'UCP1 en protéoliposomes. Des études antérieures ont cependant montré que le DPC inactive UCP1. Ces mutants ont donc été revisités dans le contexte plus physiologique des mitochondries de levure. Les mesures de respiration sur des sphéroplastes perméabilisés contenant des mitochondries exprimant les mutants ou la protéine sauvage permettent de visualiser l'activation ou l'inhibition de la protéine. Aucun défaut d'activation n'a été détecté pour les mutants K56S, K269S, ou le double mutant K56S/K269S dans notre système, réfutant ainsi les travaux de Zhao et al..Afin d'obtenir des informations sur le site de fixation des acides gras sur UCP1 deux approches ont été entreprises en parallèle. La première consiste à réaliser de la mutagenèse par triplet, un résidu dans chaque tiers de la protéine, afin d'explorer la cavité de la protéine dans sa hauteur. L'analyse des mutants par respiration à permis l'identification de deux mutants différents de la protéine sauvage : un mutant non activable par les acides gras et un mutant présentant une meilleure stimulation par les acides gras mais non inhibable par le GDP. Les premiers résultats de mutagenèse vont dans le sens d'un site de liaison des acides gras localisé dans le site commun des substrats des transporteurs mitochondriaux, probablement à proximité immédiate du site inhibiteur des nucléotides puriques.La deuxième approche fut de synthétiser des ligands fonctionnalisés avec des sondes photoactivables telle que l'AzDA (12-((4-azido-2-nitrophényl)amino)dodécanoïque)). La β-lactoglobuline (BLG), utilisée comme protéine modèle, a permis la détermination des conditions d'irradiation en solution ou sur des co-cristaux BLG/AzDA. Les premiers tests sur des mitochondries exprimant UCP1 montrent, par spectrométrie de masse linéaire, un photomarquage de la protéine.