Identification and characterisation of cell shape determinants in Helicobacter pylori
Identification et caractérisation des déterminants impliqués dans la morphologie de Helicobacter pylori
par Sofia Pires de Oliveira POMBO sous la direction de Nienke BUDDELMEIJER
Thèse de doctorat en Microbiologie
ED 562 Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le vendredi 16 novembre 2018 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • Helicobacter pylori
  • Morphologie cellulaire
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Mots clés
Helicobacter pylori, Morphologie bactériénne, AmiA, Pbp1
Resumé
Les bactéries ont des formes différentes, ronde, en spirale ou courbé, et conservent leur forme pendant la croissance et la division. La forme bactérienne est le résultat d'une adaptation évolutive en fonction des besoins de survie de chaque espèce, tels que le transport des nutriments, la respiration, la motilité et les facteurs environnementaux. Cependant, le maintien de la forme de la bactérie est également d'adaptation momentanée, c'est-à-dire en fonction de l'environnement, une modification de la forme ou une transition peut se produire pour répondre à des besoins spécifiques. La paroi bactérienne, ou peptidoglycane (PG), est responsable de maintien de la forme bactérienne et protège la cellule contre l'éclatement dû à la pression osmotique. La coordination de la croissance de la paroi au cours de l'élongation et de la division cellulaire entraîne la forme bactérienne. Comment ces deux processus sont-ils régulés et comment l'intégrité de la cellule est-elle maintenue ? Au cours des dernières années, des études réalisées sur des organismes modèles en forme de bâtonnet comme E. coli et B. subtilis ont permis d'obtenir plus de détails sur la régulation de la paroi bactérienne. Le PG est composé de chaînes de sucres réticulées par des liaisons peptidiques. Les enzymes et les protéines régulatrices qui participent à la biosynthèse et au remodelage du peptidoglycane fonctionnent principalement dans les complexes. Helicobacter pylori est une bactérie à Gram négatif qui colonise l'estomac et est la principale cause des ulcères peptiques et du cancer gastrique. Sa forme spiralée et ses flagelles polaires lui confèrent une torsion lui permettent de pénétrer dans la couche de mucus et d'atteindre des cellules épithéliales où elle colonise. H. pylori peut adopter différentes formes; des bâtonnets en spirale ou droites et des coccoids. Chez H. pylori, plusieurs protéines régulatrices de la biogenèse de PG ont été identifiées, dont AmiA, qui est prédite d'avoir une activité N-acétylmuramyl-L-alanine amidase clivant le peptidoglycane entre le squelette de sucre et les premiers acides aminés du fragment peptidique. Les mutants dans lesquels amiA est délété forment de longues chaînes de cellules filles non séparées. Nous avons abordé le rôle de AmiA chez H. pylori par quatre approches complémentaires. 1. caractérisation de la séquence protéique par une approche bioinformatique et de la structure 3D par modelisation ; 2. une approche génétique en créant des mutants dans H. pylori et en effectuant des expériences de complémentation chez un mutant amidase de E. coli ; 3. détermination de l'activité enzymatique de AmiA in vitro ; et 4. localisation de AmiA comme protéine de fusion fluorescente avec GFP chez E. coli. Sur la base de nos résultats, AmiA fonctionne différemment des autres amidases connues, car il est incapable de compléter un mutant de E. coli et ne se localise pas au site de division comme AmiC de E. coli. De plus, les mutants dirigés ciblant le site de liaison potentiel de Zn2+ n'affectent pas la morphologie de H. pylori. Nous émettons l'hypothèse que d'autres protéines impliquées dans la détermination de la forme bactérienne existent. Nous avons développé une criblage par microscopie à haut débit pour identifier de nouveaux déterminants de la forme, avec laquelle la transformation de H. pylori, la croissance et les analyses morphologiques sont réalisées sous forme de plaque à 96 puits. Une bibliothèque ordonnée de mutants de H. pylori peut être criblée dans ce système. En parallèle, nous avons étudié des interactions potentielles entre partenaires ou des protéines régulatrices de la PBP1, basées sur des analyses antérieures transcriptomiques et du protéomiques. PBP1 est la seule enzyme bifonctionnelle chez H. pylori et donc un acteur central dans la biogenèse de la PG. Plusieurs petites protéines, dont la fonction est inconnue, ont été identifiés comme potentiellement essentiels à la viabilité de H. pylori.