DM1, Répétitions CTG, Instabilité de triplets répétés, Interruptions, R-loop, Structure secondaire de l'ADN, Interaction ADN et protéines

L'instabilité des répétitions de microsatellites est un facteur clé pour plus de 40 maladies humaines. Parmi elles, la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire autosomique dominante caractérisée par un fort phénomène d'anticipation : les symptômes s'aggravent et apparaissent plus tôt d'une génération à l'autre. La DM1 est causée par une expansion de triplet CTG répétés dans la région 3'UTR du gène DMPK. Dans la population générale, la répétition CTG est stable et varie de 5 à 37 répétitions. Les patients DM1 ont des répétitions instables variant de 50 à > 1 000 CTG d'une génération à l'autre (instabilité intergénérationnelle) et dans les tissus (instabilité somatique), avec un biais vers les expansions. En général, il existe une bonne corrélation entre la longueur des répétitions anormales et la gravité des symptômes. L'instabilité des triplets CTG implique divers facteurs (réparation, transcription, structures secondaires...). Cependant, les mécanismes de contractions des triplets CTG restent peu compris. Des interruptions dans les répétitions ont été rapportées chez des patients avec une instabilité des triplets CTG réduite. Il est suggéré que les interruptions puissent être un facteur de stabilisation ou de contraction mais jusqu'à présent, aucune démonstration directe de leur impact n'a été présentée. L'objectif de ma thèse est de démontrer si les interruptions impactent l'instabilité des triplets CTG et par quels mécanismes. Nous avons étudié des familles DM1 atypiques, exemptes de phénomène d'anticipation et présentant des contractions de triplets CTG sur 2 à 4 transmissions successives. Tous les patients de ces familles présentent des interruptions : un seul CAG en 5' de la répétition CTG (famille A), ou plusieurs interruptions de la CCG en 5' ou 3' de la répétition (dans les familles B et E respectivement). Nous avons démontré que l'amplitude de l'instabilité somatique est réduite au moins pour les familles A et B. Ces d'interruptions sont de bons candidats pour étudier les mécanismes de contraction/ stabilisation des répétitions CTG. J'ai d'abord démontré in vitro que les structures secondaires de l'ADN étaient différentes entre les répétitions pures ou interrompues. J'ai ensuite comparé la fixation des protéines nucléaires aux répétitions CTG, avec ou sans interruption, par EMSA. Mes résultats ont démontré des profils de fixation différents selon la nature des répétitions. Afin d'étudier plus précisément l'impact des interruptions sur l'instabilité des répétitions, j'ai dérivé des modèles de cellules HEK293 en utilisant la technologie Phi-Integrase permettant l'intégration de plasmides d'expression. Ces cellules permettent la transcription bidirectionnelle de la région 3 'UTR du gène DMPK mutant portant des répétitions CTG pures ou interrompues avec une unique interruption CAG en 5' des répétitions CTG, reproduisant le motif identifié chez la famille A. Grâce à ce modèle, j'ai démontré que la mosaïque somatique des répétitions CTG interrompues était réduite comparée à celle présentée par les clones à répétitions pures reproduisant ainsi ce qui a été précédemment observée chez la famille A comparée à des contrôles DM1 à répétitions pures. Avec ce modèle, j'ai montré que la formation d'hybrides ADN/ARN (R-loops) est réduite dans les cellules avec une seule interruption CAG et qu'il y a une bonne corrélation entre la formation d'R-loop et le niveau de transcription de DMPK mutant antisens. Ainsi, ce modèle cellulaire démontre que l'interruption de CAG a un impact sur l'instabilité des répétitions CTG, impliquant notamment le métabolisme des R-loops. Une meilleure compréhension des mécanismes de contraction ou de stabilisation des répétitions anormales de CTG est crucial pour pouvoir guérir la DM1. Mon projet fournit de nouvelles informations sur les mécanismes de l'instabilité des triplets CTG, qui peuvent orienter vers de nouvelles cibles thérapeutiques.