Mitochondrie, Maladie mitochondriale, Mitoribosome, Traduction mitochondriale, MRPS28, MIPEP, Maturation des protéines mitochondriales, OXPHOS, CRISPR/Cas9

Les mitochondries produisent l'énergie de la cellule par phosphorylation oxydative (OXPHOS) à l'aide d'un système de 5 complexes (CI à CV). Ces complexes sont composés de protéines codées par des gènes nucléaires et mitochondriaux. Des mutations de ces gènes entraînent des défauts d'assemblage et d'activité des OXPHOS, conduisant au développement de maladies mitochondriales. L'ADN mitochondrial (mtDNA) code pour 13 protéines OXPHOS qui sont synthétisées par le ribosome mitochondrial. Des mutations de gènes codant des protéines nécessaires à l'assemblage ou au fonctionnement du mitoribosome conduisent donc à des anomalies OXPHOS et ainsi à des maladies mitochondriales. La plupart des protéines mitochondriales d'origine nucléaire sont importées vers la mitochondrie à l'aide d'une séquence d'adressage située en N-terminal de la protéine. Cette séquence est clivée une fois dans la mitochondrie par la peptidase MPP. Un deuxième clivage par la peptidase MIPEP est nécessaire pour certaines protéines mitochondriales, et pourrait stabiliser ou activer ces protéines. Des mutations du gène MIPEP ont récemment été identifiées chez quatre patients présentant notamment des anomalies cardiaques (non-compaction du ventricule gauche). La première partie de ma thèse identifie le gène MRPS28 comme étant le gène causal de la maladie d'un patient présentant des atteintes multi-systémiques avec notamment un retard de développement psychomoteur, et des atteintes hépatiques et neuronales. Mon travail caractérise le phénotype moléculaire dans les fibroblastes de ce patient. J'ai ainsi observé une diminution de la quantité de la protéine MRPS28, une diminution quantitative de la petite sous-unité du mitoribosome et une inhibition de la traduction mitochondriale. L'assemblage et l'activité des OXPHOS étaient également très diminués. L'expression de MRPS28 sauvage a restauré la traduction mitochondriale et l'assemblage des OXPHOS, démontrant que MRPS28 est bien le gène responsable de la maladie. La deuxième partie de ma thèse tente de caractériser le rôle de MIPEP dans la mitochondrie. Un séquençage d'exome a permis d'identifier des mutations du gène MIPEP chez un patient atteint de retard de croissance et de retard psychomoteur, d'un syndrome cérébelleux, d'ataxie et d'une neuropathie axonale. La protéine MIPEP était quantitativement diminuée, et MRPL12 présentait un défaut de maturation dans les fibroblastes du patient. J'ai également observé un défaut d'assemblage des complexes CIV et CV et un défaut de l'activité du CI dans les fibroblastes du patient. L'expression de MIPEP sauvage restaurait ces phénotypes, confirmant que MIPEP est le gène causal de la maladie du patient. J'ai également observé un défaut de maturation de certaines protéines OXPHOS : NDUFV2 (CI), NDUFS8 (CI), SDHA (CII), ATP5F (CV), ATP5O (CV) et de OXA1L, nécessaire à l'assemblage des OXPHOS. Deux modèles indépendants de cellules HEK293FT inactivées pour MIPEP par CRISPR/Cas9 présentaient des phénotypes similaires à celui des fibroblastes du patient : diminution quantitative de MIPEP ; défaut de maturation de MRPL12 ; et défaut de maturation de NDUFS8, ATP5F, ATP5O et OXA1L. Cependant, NDUFV2 et SDHA ne présentaient pas de défaut de maturation, suggérant que MIPEP n'est que partiellement inactivé dans ces modèles CRISPR/Cas9. La mise en place du séquençage N-terminal protéomique d'extraits mitochondriaux de contrôles et de ces modèles CRISPR/Cas9 par la technique des TAILS (Terminal Amine Isotopic Labeling of Substrates) n'a pas permis de confirmer les substrats OXPHOS identifiés, ni d'en identifier de nouveaux. Ma thèse apporte de nouvelles informations sur le fonctionnement des protéines MRPS28 et MIPEP, ce qui permettra d'aider à la compréhension des mécanismes des maladies mitochondriales associées à des défauts de synthèse et de maturation des protéines mitochondriales chez l'homme.