Étude du potentiel des pFAR4, miniplasmides dépourvus de gène de résistance à un antibiotique, comme vecteurs pour la thérapie génique
Study of the potential of pFAR4s, miniplasmids free of antibiotic resistance markers, as vectors for gene therapy
par Pastor Marie sous la direction de Scherman Daniel
Thèse de doctorat en Biotherapies et biotechnologies
École doctorale Hématologie, Oncogenèse et Biothérapies

Soutenue le Tuesday 12 July 2016 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • Escherichia coli
  • Résistance aux antibiotiques
  • Thérapie génique
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Mots clés
Plasmide dépourvu de gène de résistance à un antibiotique, Thérapie génique non virale, Transposon, Sleeping Beauty, Injection hydrodynamique, Hépatocytes
Resumé
L'un des principaux défis de la thérapie génique est d'identifier un vecteur sûr capable d'assurer un transfert efficace et une expression soutenue d'un gène d'intérêt thérapeutique dans les cellules cibles. L'émergence de vecteurs plasmidiques de nouvelles générations a permis d'atteindre ces objectifs et de considérer la thérapie génique non virale comme une alternative prometteuse aux vecteurs viraux pour le traitement de maladies génétiques ou acquises. Appartenant à ces nouvelles générations, les dérivés du vecteur pFAR4 sont des miniplasmides dépourvus de gène de résistance à un antibiotique. Leur propagation dans les cellules d'Escherichia coli est basée sur la suppression d'une mutation non-sens de type ambre introduite dans un gène essentiel de la souche productrice, permettant ainsi d'éliminer les risques associés à l'utilisation de gène de résistance à un antibiotique tout en diminuant la taille du vecteur. Le but de cette thèse est d'étudier le potentiel de ces vecteurs dans deux contextes de thérapie génique non virale : Dans une première approche, le potentiel du vecteur pFAR4 a été évalué pour l'expression d'un gène thérapeutique dans le foie de souris. Pour ce faire, un dérivé de ce vecteur exprimant le gène Sgsh à partir d'un promoteur spécifique des hépatocytes et codant la protéine sulfamidase, protéine défectueuse chez les patients souffrant de la maladie de Sanfilippo de type A, a été administré par injection hydrodynamique à des souris. Nous avons montré que le vecteur pFAR4 promeut dans le foie une expression élevée et soutenue de la sulfamidase, qui décline rapidement lorsque le gène Sgsh est administré par un vecteur contenant un gène de résistance à la kanamycine. Dans le cadre de cette étude, il a été établi que le profil d'expression obtenu avec le vecteur pFAR4 n'est pas lié à son insertion dans le génome des hépatocytes mais résulte, de par sa taille réduite, d'une protection contre les phénomènes d'extinction de transgène couramment observés in vivo avec les vecteurs conventionnels. Dans une seconde approche, le vecteur pFAR4 a été combiné à la technologie Sleeping Beauty (SB), dont l'un des constituants majeurs est la transposase hyperactive SB100X qui promeut la transposition d'un transgène, en l'excisant du plasmide qui le porte et en l'insérant dans le génome des cellules hôtes. Cette combinaison a été étudiée in vitro dans des cellules HeLa, en utilisant un transposon contenant soit le gène de résistance à la néomycine soit le gène codant la protéine fluorescente Vénus. Nous avons ainsi montré que le plasmide pFAR4 constituait un vecteur efficace pour les composants du système SB et que la combinaison pFAR4/SB conduisait à un taux de transgénèse augmenté par rapport à une association avec des plasmides conventionnels. Cette efficacité élevée résulte d'un niveau de transfection et d'un taux d'excision augmentés, tous deux favorisés par la taille réduite du plasmide. La combinaison pFAR4/SB devrait prochainement être utilisée pour transférer le gène codant le facteur anti-angiogénique PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) à des cellules primaires de l'épithélium pigmentaire de la rétine ou de l'iris dans deux essais cliniques (Phase I/II) de thérapie génique ex vivo pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA).