Évolution dirigée, Enzymes, Ingénierie enzymatique, Microfluidique, Bioingénierie, Programmes moléculaires

Les méthodes d'évolution dirigée basées sur les techniques de sélection se sont révélées être très efficaces dans plusieurs travaux mais reposent sur la possibilité de trouver un outil de sélection au cas par cas qui permet de lier l'activité d'une enzyme à la propagation de son gène. Dans une approche inspirée de la CSR (Compartmentalized-Self-Selection) de Ghadessy et al. (1) nous proposons d'utiliser des réseaux moléculaires artificiels pour créer des fonctions de sélection adaptables à des enzymes de natures variées. Notre processus d'auto-sélection implique l'utilisation de programmes moléculaires relativement simples en tant que boucle de rétrocontrôle liant directement l'activité de l'enzyme avec le rendement de la PCR de son propre gène. Les programmes moléculaires mis à l'œuvre dans cette méthode d'évolution utilisent la PEN DNA Toolbox (2). Basés sur l'interaction de courts brins d'ADN et d'un ensemble restreint de 3 types d'enzymes (polymérases, exonucléases et nickases) ils permettent de générer de courts oligonucléotides de séquences prédéterminées à partir d'une variété de signaux d'entrée comme un autre brin d'ADN ou une activité enzymatique. Il est donc possible d'utiliser ces programmes moléculaires pour générer des amorces de PCR ciblant le gène à évoluer et ce en quantité dépendante de l'activité enzymatique. De cette manière le rendement en produit de PCR du gène est directement lié à son activité. L'utilisation de programmes moléculaires permet entre autres de pouvoir contrôler cette relation de manière assez précise et d'influencer la fonction de sélection. La relative simplicité de design et d'utilisation des programmes moléculaires permet aussi de pouvoir agir aisément sur la sélection à chaque cycle et de changer les paramètres assez facilement. Enfin le caractère extracellulaire de ces programmes permet de pouvoir tester les enzymes dans des conditions non-naturelles in vitro. Pour pouvoir réaliser le nombre important de tests requis par les expériences d'évolution dirigée, nous utilisons des gouttes d'eau-dans-l'huile générées par microfluidique afin de créer des compartiments de taille homogène pouvant chacun accueillir un mutant et les réactifs nécessaires. Après génération d'une banque de mutants par PCR error prone, des bactéries contenant et exprimant les mutants sont séparées individuellement dans ces gouttes contenant le programme moléculaire. Le processus est ensuite simplement initié en augmentant la température à 45°C, après un certain temps d'incubation une concentration d'amorces dépendante de l'activité de l'enzyme est atteinte. On lance alors une dont le rendement dépendra de la concentration d'amorces. Après cassage de l'émulsion on retrouve une banque de mutants enrichies avec les meilleurs gènes qui sera utilisée pour créer une nouvelle banque et répéter les cycles d'évolution.L'enzyme étudiée comme premier modèle de cette méthode d'auto-sélection est une des nickases utilisées dans les programmes moléculaires de la PEN DNA Toolbox : Nt.Bst.NBI. Les étapes de développement de cette nouvelle méthode ont permis d'optimiser les conditions de cultures et de co-encapsulation des bactéries avec les réactifs nécessaires à l'étape de programmation moléculaire et de PCR. Elles ont rendu possible la sélection du gène wild-type de Nt.Bst.NBI parmi une large majorité de mutants inactifs passant d'une fraction initiale de 10% à une fraction finale de 90% en un seul cycle démontrant ainsi la forte capacité de sélection de la méthode. Les cycles de sélection sur une banque de mutant de cette même enzyme sont en cours et l'analyse des résultats de séquençage NGS des mutants sélectionnés dans un tout premier cycle montre déjà les signes d'une sélection efficace.