Rcpg, Ghsr, Échafaudage ADN, Biophysique, Spectroscopie de force SMFS, Frb/fkbp12, Interaction protéine-protéine, Expression membranaire, J-Dna

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent une vaste famille de protéines membranaires impliquées dans de nombreux processus physiologiques et représentant des cibles majeures en pharmacologie. Parmi eux, le récepteur de la ghréline (GHSR) présente un intérêt particulier en raison de son activité constitutive élevée et de son rôle central dans la régulation énergétique. Cette thèse s'inscrit dans le développement d'un dispositif d'échafaudage ADN de type J-DNA destiné à l'étude du GHSR par spectroscopie de force en molécule unique. Initialement, l'échafaudage devait être fourni par nos collaborateurs, ce qui devait permettre de débuter rapidement les études sur le récepteur. Cependant, des contraintes techniques et logistiques nous ont conduit à mettre en place, en parallèle, un protocole interne de synthèse de l'échafaudage ADN. Une part majeure du travail a ainsi été consacrée à la synthèse de novo et à la validation expérimentale d'un nouvel échafaudage ADN. Cette structure a été conçue à partir de séquences d'oligonucléotides modulaires, permettant un assemblage contrôlé et une géométrie adaptée à l'immobilisation de protéines membranaires purifiées. Sa mise au point a nécessité l'élaboration de nouvelles étapes d'assemblage, de purification et de vérification par électrophorèse. Un test fonctionnel a ensuite été réalisé à l'aide du couple protéique modèle FRB/FKBP12, dont l'interaction dépendante de la rapamycine constitue un système de validation fiable pour des approches d'interaction dirigée. Ces expériences ont permis de démontrer la fonctionnalité du nouvel échafaudage ainsi que sa compatibilité avec différents systèmes protéiques bien caractérisés dans la littérature. En parallèle, un important travail d'optimisation a été mené sur la construction du GHSR, dans le but d'améliorer son expression, sa purification et sa renaturation. Ces optimisations, réalisées par l'entièreté de notre équipe de recherche, ont permis d'obtenir des échantillons de meilleure qualité et de préparer les premières mises en place de visualisation du GHSR sur échafaudage par microscopie, ouvrant la voie à de futures études d'interaction au niveau moléculaire. Ce travail a permis d'établir les fondations expérimentales d'un dispositif d'étude de biomolécules fondé sur des échafaudages ADN. Au-delà du cas du GHSR, les protocoles développés ici constituent une plateforme adaptable et modulaire, applicable à un large éventail de biomolécules compatibles avec ce type d'architecture, et ouvrent ainsi de nouvelles perspectives pour l'exploration des interactions biomoléculaires à haute résolution.