Protéines membranaires, Expression hétérologue, S, Cerevisiae, Solubilisation, Purification, Protéine découplante, Ucp1, Mitochondries

La protéine découplante UCP1 est une protéine de la membrane interne des mitochondries du tissu adipeux brun. Activée par les acides gras à chaine longue, UCP1 permet le passage des protons de l'espace intermembranaire vers la matrice mitochondriale, découplant ainsi la chaîne respiratoire de la production d'ATP. Ceci mène à un emballement du métabolisme oxydatif des substrats (glucides et lipides) produisant ainsi de la chaleur. En absence d'activation du tissu adipeux brun, cette protéine est inhibée par les nucléotides puriques. La récente résolution des structures d'UCP1 n'a pas répondu à la question concernant le mécanisme du passage des protons et de sa régulation. Le travail réalisé durant ce doctorat s'est concentré sur la partie expérimentale du projet, dans la suite de ce qui a été étudié au laboratoire en dynamique moléculaire et en mesures de respiration cellulaire. L'objectif est alors d'étudier la protéine purifiée et ses interactions avec ses régulateurs, et idéalement de résoudre sa structure, permettant ainsi de comprendre le mécanisme de transport de protons. La première partie du travail se focalise sur la production recombinante d'UCP1 dans la levure S. Cerevisiae. Le but est d'obtenir une quantité suffisante d'UCP1 purifiée, monodisperse, fonctionnelle et stable dans un détergent adapté. Pour cela, un nouveau protocole d'expression d'UCP1 dans la levure et une méthode originale de double purification sont développés. Nos résultats montre que l'ajustement de l'activité du promoteur galactose en diminuant la quantité de galactose de 300 fois de ce qui est fait dans la littérature permet une solubilisation efficace des protéines membranaires recombinantes, non seulement dans E. coli où cette idée est connue, mais aussi dans les systèmes d'expression eucaryotes. Cette stratégie élimine alors la toxicité d'expression d'UCP1 dans la levure, et convient à des cultures à grande échelle. Une induction lente sur la nuit avec 0.003% galactose au début de la phase exponentielle et combinée à une supplémentation d'acides aminés s'avère être l'étape clé pour une bonne qualité et une quantité élevée d'UCP1. Vu son succès sur la flippase ATP7B, cette stratégie peut être alors généralisée sur la totalité des protéines membranaires. Grâce à cette méthode innovante, pour une première fois au sein de notre laboratoire, nous obtenons un rendement élevé d'UCP1 purifiée (200 µg/L), homogène selon les résultats de SEC-MALLS et active après reconstitution en liposomes. La deuxième partie du projet constitue alors la suite expérimentale de la récente découverte du mutant super actif (activité basale et induite par les acides gras) et non sensible aux nucléotides. Il s'agit du triplet FIW88 (constitué des résidus F88, I187, W281). Sa caractérisation se base alors sur l'activité de transport de protons en liposomes, ainsi que sur des mesures de liaison avec les nucléotides. Nos résultats confirment le phénotype de ce mutant in vitro : une activité basale élevée et une sur-activation en réponse aux acides gras. La mutation des 3 acides aminés révèle une perte de liaison au GDP fluorescent. Selon le profil SEC-MALLS, ce mutant se comporte aussi bien que la protéine sauvage. Pour une première fois dans la littérature, nous arrivons à discerner entre la toxicité due à la surexpression d'UCP1 en levures, et celle qui est due à son activité découplante médiée par la mutation. Enfin, cet avancement majeur du projet nous permet d'avancer vers la caractérisation structurale d'UCP1 et de son mutant par cryo-EM ou crystallographie aux rayons X ainsi que d'approfondir nos études fonctionnelles sur UCP1 et d'autres membres de la famille. Notre maîtrise de l'expression recombinante dans la levure confirme qu'il s'agit d'un système avantageux pour l'expression des protéines membranaires en biologie structurale, nous permettant de générer des mutants qui étaient auparavant impossibles à produire dans les cellules de mammifères.