Transporteur membranaire, Métallophore, Pseudomonas aeruginosa, Biologie structurale, Cristallographie, Détergent, CntI, MexB, Pseudopaline, Phénylalanine-Arginine ß naphtylamide

L'homéostasie des métaux, la métallostasie, est essentielle aux organismes vivants et plus particulièrement à la physiologie bactérienne. Les métallophores sont des métabolites spécialisés dans la capture et le transport des ions métalliques. En contexte infectieux, ces chélateurs biochimiques jouent un rôle crucial chez les bactéries pathogènes à l'interface hôte-microorganisme où se joue une « immunité nutritionnelle » de l'hôte, processus qui tend à séquestrer et donc à priver la bactérie d'ions métalliques. Chez le pathogène à Gram négatif, multirésistant aux antibiotiques Pseudomonas aeruginosa, la pseudopaline a été découverte comme un métallophore essentiel à la capture des ions Zn2+ et Ni2+ extracellulaires. Sa sécrétion et son import sont assurés par différentes familles de transporteurs membranaires dont la compréhension des mécanismes moléculaires pourrait servir de base à de nouvelles stratégies antibactériennes. L'objectif du projet de thèse porte sur la compréhension des bases moléculaires de l'export de la pseudopaline à travers la paroi cellulaire de P. aeruginosa. Ce processus implique l'exportateur de la membrane interne CntI, membre de la superfamille peu étudiée des transporteurs de médicaments/métabolites (DMT), et la pompe d'efflux tripartite MexAB-OprM de la famille RND (Resistance Nodulation cell Division), connue pour son rôle dans la résistance aux antibiotiques. La production, purification, concentration et la stabilité de CntI ont été optimisées grâce à des techniques telles que la diffusion de lumière multi-angle couplée à la chromatographie d'exclusion stérique (SEC-MALS) et le thermofluor, menant à des premières pistes de cristallisation de CntI. En parallèle, des analyses de docking in silico avec un modèle structural ont révélé des résidus potentiellement critiques dans la poche de liaison de CntI, dont le résidu R73 confirmé par des études fonctionnelles de mutagenèse dirigée et de complémentation par nos collaborateurs. De plus, la dimérisation de CntI, sensible au pH et à la concentration saline, a été démontrée, corroborant un probable rôle fonctionnel de la dimérisation des DMT. Par ailleurs, nous avons obtenu la structure cristallographique de MexB en complexe avec l'inhibiteur de référence PAβN (Phénylalanine-arginine β-naphtylamide), ainsi que celle de MexB avec la pseudopaline, le seul ligand physiologique de MexB décrit à ce jour. En outre, les affinités de liaison pour les complexes MexB/PAβN, MexB/pseudopaline, CntI/pseudopaline et CntI/MexB ont été mesurées via la technique de décalage spectral isotherme. Ainsi, nos résultats montrent une interaction spécifique de la pseudopaline avec CntI et MexB. D'autre part, une interaction entre CntI et MexB a été mesurée avec une affinité d'environ 90 nM, suggérant une association fonctionnelle inédite entre ces deux transporteurs. L'ensemble de ces résultats soutient l'implication de MexAB-OprM dans le "pseudopalome" qui propose une colocalisation cellulaire des différentes protéines impliquées dans la biosynthèse et la sécrétion de la pseudopaline.