Organoïde rénal, Syndrome d'alport lié à l'X, Néphrogénétique, Oligonucléotide antisens (ASO), ADTKD, MUC1, VNTR

L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche environ 10 % de la population mondiale. Malgré la prévalence de l'IRC, sa cause reste inconnue chez au moins 20 % des patients. Les options thérapeutiques sont également limitées en raison de la complexité de la biologie rénale et de l'absence de modèles in vitro reproduisant fidèlement le rein mature. Mes recherches se sont concentrées sur deux objectifs principaux. Premièrement, nous avons cherché à améliorer le diagnostic génétique pour les patients atteints d'IRC en particulier pour la recherche de variants difficile d'accès par les techniques standards, deuxièmement, nous avons développé un modèle robuste d'organoïdes rénaux in vitro pour mieux comprendre la maladie et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Tout d'abord, compte tenu des difficultés à établir un diagnostic génétique chez les patients atteints d'une maladie tubulo-interstitielle associée à des variants pathogènes du gène MUC1 (ADTKD-MUC1), j'ai mis au point un outil informatique pour génotyper les répétitions en tandem à nombre variable (VNTR) codantes du gène MUC1. J'ai développé l'utilisation de VNtyper, un outil basé sur Python qui utilise une méthode de génotypage sans alignement, pour un génotypage rapide et précis du VNTR. J'ai analysé le séquençage de 108 cas avec variations MUC1 et 4040 patients testés pour des maladies rénales. VNtyper a re-diagnostiqué des cas inconnus et identifié 35 nouveaux patients. La deuxième maladie rénale héréditaire sur laquelle nous avons travaillé est le syndrome d'Alport lié à l'X (XLAS) qui est dû à des mutations dans le gène COL4A5, codant pour la chaîne '5 du collagène IV ['5(IV)], et qui se caractérise par une altération de la barrière de filtration glomérulaire et des podocytes, entraînant une fuite importante de protéines dans les urines. En appliquant une approche ciblée de séquençage d'ARN à 19 patients présentant un phénotype typique du syndrome d'Alport sans variants pathogènes identifiés, nous avons mis en évidence des variants d'épissage chez tous les patients. Comme ces variations se prêtent à une thérapie par oligonucléotides antisens (ASO), j'ai conçu plusieurs ASO que j'ai testés dans les fibroblastes dérivés de patients. Pour atteindre le deuxième objectif de ma recherche, j'ai appliqué la technologie CRISPR/Cas9 pour introduire indépendamment deux variations introniques profondes et un tag V5 dans le gène COL4A5 dans des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs) mâles, et les différencier en organoïdes rénaux. Pour quantifier les transcrits mutants et sauvages de COL4A5 dans les organoïdes, j'ai utilisé les techniques de séquençage ciblé de l'ARN et l'analyse de fragments. De plus, pour mieux caractériser l'état de développement de notre modèle organoïde, des études de séquençage de cellule unique et de protéomique ont été réalisées sur des organoïdes isogéniques contrôles et mutants aux jours 22 et 38 de la différenciation, afin de suivre la maturation des organoïdes, et en particulier la maturation de la MBG. Des études par immunofluorescence de l'expression des chaînes de collagènes IV ['1 à '6] et des laminines ['5, '1, et '2] ont permis de confirmer l'état de maturation de la MBG. Nous avons également développé une macro Fiji assistée par l'intelligence artificielle pour quantifier les variations de l'expression de la chaîne '5(IV) dans la MBG. Enfin, l'administration de 2'O-méthyl (2'OMe)-ASO dans le modèle d'organoïdes n'étant pas très efficace, je suis passé à l'utilisation d'une structure de type phosphoroamidate morpholino oligomer (PMO) et j'ai développé un protocole de transfection efficace qui a permis le rétablissement de l'épissage canonique (présence du transcrit sauvage) du gène COL4A5 dans les organoïdes rénaux. En utilisant ce protocole, j'ai pu restaurer l'expression et la localisation de la protéine COL4A5 dans les membranes basales des organoïdes rénaux.