Mots clés |
S cerevisiae, Criblage génétique, 2-désoxyglucose, Résistance au 2DG, Signalisation du glucose, Snf1/AMPK, Signalisation AMPK, Interactions protéine-protéine, NanoBiT |
Resumé |
La levure Saccharomyces cerevisiae fermente préférentiellement le glucose. Le glucose inhibe l'utilisation de sources de carbone alternatives en contrôlant l'expression des gènes et le métabolisme via une voie centrée sur le complexe hétérotrimérique de la kinase Snf1/AMPK, un orthologue de l'AMPK des mammifères. Snf1, active en conditions de carence, est inhibée en présence de glucose par déphosphorylation via le complexe phosphatase PP1 (composé d'une sous-unité catalytique, Glc7, et d'une sous-unité régulatrice, Reg1). Comprendre comment le glucose active l'inhibition de Snf1 par PP1 au niveau mécanistique reste une question ouverte. Pour explorer cette problématique, nous avons utilisé le 2-désoxyglucose (2DG), un analogue du glucose qui déclenche une réponse semblable à celle du glucose, entraînant la déphosphorylation de Snf1, ainsi que la capacité de la levure à développer une résistance à cette molécule via des mutations spontanées. Un criblage génétique nous a permis d'isoler environ 200 mutants résistants au 2DG. Parmi ceux-ci, nous avons caractérisé fonctionnellement cinq mutants ponctuels affectant Reg1. Ces mutants ne présentent aucun défaut d'activité de Snf1 à l'état stationnaire, mais montrent une réponse altérée au 2DG. De manière intéressante, un mutant particulier n'a montré aucune réponse au 2DG. Une analyse protéomique a révélé qu'en réponse au 2DG, la forme sauvage (WT) de Reg1 présente une interaction accrue avec toutes les sous-unités du complexe Snf1/AMPK, entraînant la déphosphorylation de Snf1. Afin d'étudier plus précisément la dynamique de l'interaction entre Reg1 et Snf1, et d'étendre cette analyse aux mutants de Reg1, nous avons développé un essai basé sur la complémentation réversible de la NanoLuciférase (NanoBiT®). Cet outil permet de suivre en temps réel les interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes. Nous avons observé une interaction transitoire entre Reg1 (WT) et Snf1 dans les minutes suivant le traitement par le 2DG, interaction qui est altérée dans le cas du mutant. Ces résultats ouvrent la voie à une investigation approfondie des interactions régulées par le glucose/2DG entre Reg1 (PP1) et Snf1, ainsi qu'à leur rôle dans la régulation métabolique de l'activité de Snf1. |