| Resumé |
Les quasi-espèces virales, représentant la grande diversité génétique du virus de l'immunodéficience humaine, permettent l'émergence de variants résistants aux antirétroviraux (ARV) sous pression de sélection médicamenteuse sous-optimale. De plus, l'intégration de l'ADN double brin viral dans le génome humain constitue un réservoir viral dans les cellules cibles du virus, sur lequel les ARV ne sont pas actifs, ce qui empêche toute éradication. Le réservoir est principalement constitué de virus défectifs, non compétents à la réplication en raison de grandes délétions internes au niveau de leurs génomes ou d'hypermutations dues à l'action de la protéine cellulaire APOBEC3 dont l'action est contrecarrée par le facteur de restriction viral Vif. L'infection par le VIH-2 est considérée comme une infection atténuée en raison de la faible réplication virale, d'une progression clinique plus lente, d'une charge virale plasmatique spontanément indétectable chez 70% des patients et d'un faible taux de transmission. Ce projet de thèse a pour but la caractérisation de la composition du réservoir VIH dans différentes situations physiopathologiques des infections par le VIH-1 et le VIH-2. Pour ce faire, nous avons utilisé les prélèvements de cellules périphériques mononucléées sanguines (PBMC) de deux groupes de patients : Patients vivant avec le VIH-1 traités efficacement inclus dans l'essai ANRS 167 LAMIDOL évaluant l'efficacité d'une bithérapie de maintenance par dolutegravir et lamivudine. Patients non traités inclus dans la Cohorte Nationale ANRS VIH-2. À partir des PBMC, nous avons réalisé une extraction d'ADN suivie d'une première PCR et d'une PCR nichée ciblant deux régions du génome : (i) les régions transcriptase inverse (TI), protéase et intégrase du gène Pol en tant que région cible des mutations de résistance aux ARV, certaines pouvant être générées par l'activité d'APOBEC ; et (ii) Vif pour son implication dans la neutralisation d'APOBEC. Les amplicons obtenus ont été séquencés par séquençage haut débit (Oxford Nanopore) et un programme informatique a été développé pour identifier les reads défectifs induits par APOBEC3 ainsi que les mutations de résistances aux ARV induites par APOBEC3 (APOMuts). Toutes les séquences hypermutées et celles contenant au moins un codon stop ont été considérées comme défectives. Des séquences provirales défectives du gène de la TI ont été retrouvées chez 38% et 42% des patients de l'essai LAMIDOL à S-8 et S48 respectivement, et dans Vif chez 22% et 29% des patients, respectivement. Au moins une APOMut était présente dans les provirus de 27% et 38% des patients à S-8 et S48, respectivement. Le ratio APOMuts/nombre de sites potentiels d'APOMuts était significativement plus élevé à S48 (16.5%) qu'à S-8 (9,8%, p=0,007). Pour les 57 patients de la cohorte nationale ANRS VIH-2, nous avons ciblé les régions du gène Pol codant la protéase, la TI et l'intégrase ainsi que le gène Vif. Nous avons réussi à obtenir les séquences virales de la TI et de la protéase de 32 participants (56%). Parmi ces séquences, 41% des participants présentent un VIH-2 faisant partie du groupe A (n=13) et 23% de ces derniers présentaient des séquences virales défectives (n=3). Parmi les participants infectés par le VIH-2 du groupe B (59%, n=19) 11% présentaient des virus défectifs (n=2). Nous avons développé la technique d'intact proviral DNA assay par digital droplet PCR (ddPCR) pour le VIH-2. Cette technique permet de quantifier les provirus intacts et défectifs présentant de grandes délétions au niveau de leurs génomes. Nous avons réalisé des séparations par gradient Ficoll à partir de sang total puis une sélection de lymphocytes CD4+ afin d'optimiser les résultats. Après l'extraction d'ADN, nous avons réalisé une ddPCR en multiplex en utilisant deux couples d'amorces ; le premier ciblant la région 5' et le deuxième la région 3' du génome viral. Les résultats obtenus sont en cours d'analyse |