Vésicules extracellulaires, Optogénétique, CD63, Cre, Échappement endosomal, Délivrance fonctionnelle, VSV-G, Poisson zèbre, Imagerie

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures lipidiques sécrétées par tous les types de cellules étudiés jusqu'à présent. Une fois libérées, elles peuvent traverser différentes barrières biologiques pour cibler les cellules réceptrices localement et systémiquement. Leur composition et leur contenu indiquent l'état physiologique de la cellule productrice et, par conséquent, elles ont suscité une grande attention pour leur utilisation dans des applications cliniques en tant que biomarqueurs non invasifs. Par ailleurs, la capacité des VE à cibler et à délivrer du matériel aux cellules réceptrices a positionné les VE comme des nanovéhicules intéressants pour le traitement d'un large éventail de maladies. Dans les cellules réceptrices, les VE peuvent être endocytées et dégradées, à moins qu'elles ne subissent un échappement endosomal, qui est une étape critique dans la délivrance fonctionnelle des VE et reste l'obstacle principal de plusieurs approches thérapeutiques prometteuses à base de nanoparticules. Actuellement, plusieurs stratégies existent pour charger des biomolécules spécifiques dans les VE et pour favoriser l'échappement endosomal. Cependant, les mécanismes soutenant la délivrance fonctionnelle sont encore mal compris et les acteurs moléculaires associés à ce processus restent largement inconnus. Dans ce travail, nous avons décidé de nous concentrer sur le chargement de protéines pour étudier le transfert fonctionnel puisque la majorité des études sont basées sur le transfert d'acides nucléiques. Nous avons évalué plusieurs stratégies innovantes pour charger des protéines spécifiques dans la lumière des vésicules et examiné leur devenir dans les cellules réceptrices équipées d'un rapporteur afin de mieux comprendre ce processus. Ici, nous avons développé un système optogénétique qui permet le contrôle temporel du chargement de cargo dans les VE par la lumière bleue, par des interactions transitoires. Nous avons adapté les protéines optogénétiques eMagA et eMagB pour charger de manière réversible la protéine Cre dans les vésicules CD63+ lors d'une stimulation lumineuse, afin de cibler un système Cre-loxP dans les cellules réceptrices. Cette stratégie utilise CD63 marqué par fluorescence, qui a été précédemment développé dans le laboratoire pour étudier la biogenèse et le devenir des exosomes et nous permet de suivre les vésicules in vitro et in vivo. Nous montrons que le système optogénétique utilisant des eMags favorise une translocation du cargo du noyau vers le cytoplasme lors d'une stimulation lumineuse, ce qui nous a permis d'augmenter la quantité de Cre chargée dans les VE nouvellement formées sans affecter la taille ou la morphologie des vésicules. In vivo, nous avons utilisé la souche de poisson zèbre Hulk, qui exprime de manière ubiquitaire le rapporteur Cre lox-GFP, pour suivre les VE à l'échelle de la vésicule unique et évaluer les capacités de relargage de protéines fonctionnelles par les VE. Comme d'autres avant nous, nous confirmons in vitro et in vivo que le transfert fonctionnel de protéines ne se produit pas naturellement. L'échappement endosomal semble dépendre fortement d'une quantité massive de vésicules et de l'ajout de protéines virales fusogènes à la surface des VE telles que VSV-G. Dans ce travail, nous avons développé une stratégie innovante de chargement de protéines dans les VE qui a été utilisée pour mieux comprendre la capacité des VE en tant que véhicules de transfert de matériel. Bien que nous puissions favoriser la délivrance fonctionnelle de protéines dans les cellules réceptrices en surexprimant la protéine VSV-G, nos résultats indiquent une faible capacité des VE à délivrer des protéines par fusion membranaire avec la cellule réceptrice. Cela nous incite à reconsidérer les capacités intrinsèques des VE à transférer efficacement leur contenu et à modifier la physiologie de leurs cibles, et met en perspective la faisabilité des VE en tant que nano-véhicules thérapeutiques.