| Resumé |
L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique cutanée grave causée par des mutations de perte de fonction dans le gène COL7A1 codant pour le collagène VII (C7). Les patients atteints d'EBDR souffrent depuis la naissance de bulles sur la peau et les muqueuses et développent des complications locales et générales sévères, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont démontré un potentiel d'amélioration de la cicatrisation et de l'inflammation cutanée chez les patients atteints d'EBDR via leur capacité à exprimer le C7 et leurs propriétés anti-inflammatoires. Le but de ce travail est d'optimiser le conditionnement in vitro des CSM dérivées de la moelle osseuse humaine (CSM-MO) afin d'améliorer leur survie après injection dans des modèles murins. Tout d'abord, des CSM-MO de donneurs sains ont été transduites avec un vecteur lentiviral codant pour les protéines reportrices firefly luciferase et mCherry, sans altérer leur phénotype de CSM. Ensuite, les CSM-MO Fluc+/mCherry+ ont été soumises à différentes conditions de culture : (1) en milieu supplémenté en sérum de veau foetal ou en lysat plaquettaire humain, (2) la culture en monocouche sur plastique ou en sphéroïdes et (3) en hypoxie (5% O2) ou en normoxie (21% O2). Ensuite, ces cellules ont été injectées par voie intraveineuse (IV) ou intradermique (ID) dans des modèles murins. Leur survie in vivo et leur biodistribution ont été évaluées par imagerie in vivo. Comme indiqué dans la littérature, nous avons observé qu'après une injection IV, une majorité de CSM-MO était séquestrées dans les poumons. Cependant, une fraction de CSM-MO est capable de s'échapper des poumons et est détectée dans les reins avant d'être éliminé dans les urines. L'échappement à la séquestration pulmonaire semble être favorisé par les conditions de culture en sphéroïdes. En effet, 24 heures après l'injection, le signal de luminescence détecté dans les reins pour les CSM-MO en culture monocouche correspond au signal observé en culture sphéroïde dès 3 heures après l'injection. Par ailleurs, des résultats précédents ont montré que les CSM-MO injectées par voie ID avaient une durée de vie de 4 mois dans des conditions de culture in vitro standard. Cependant, bien que la plupart des CSM-MO injectées soient mortes au cours des deux premiers mois pour toutes les conditions testées, une sous-population (10 %) de CSM-MO a persisté entre 35 à 61 semaines après l'injection. Nous avons prélevé des échantillons de peau murine dans lesquelles avaient été injectées en ID des CSM-MO, deux mois après l'injection et analysé la sous-population survivante par immunomarquage et transcriptomique spatiale. En parallèle, nous avons analysé les CSM-MO cultivées dans les différentes conditions avant l'injection par séquençage de l'ARN en single-cell (scRNAseq). Nos résultats indiquent que les cellules survivantes étaient initialement présentes dans la population cellulaire injectée. Les données transcriptomiques spatiales indiquent que ces cellules survivantes maintiennent l'expression de THY1, ENG et NT5E in vivo et partagent plusieurs caractéristiques avec les fibroblastes cutanés. Elles expriment COL7A1 et ont une expression enrichie en gènes impliqués dans les constituants de la matrice extracellulaire, l'organisation des fibres de collagène ce qui présente une option thérapeutique importante pour la cicatrisation des plaies. L'identification et la caractérisation de cette sous-population distincte de CSM-MO capable de survivre à long terme après l'injection ID permettrait proposer des protocoles de thérapie cellulaire améliorés pour l'EBDR avec des effets durables. |