Barrière hémato-encéphalique, Microfluidique, Lc-Ms/ms, Enrichissement, Protéines de la membrane plasmique, Transporteurs, Récepteurs, Jonctions serrées

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure complexe localisée au niveau des microvaisseaux cérébraux. Elle sépare le système nerveux central (SNC) du système sanguin. Les deux fonctions principales de la BHE consistent à protéger le SNC des molécules toxiques et à réguler l'homéostasie du SNC afin de garantir son bon fonctionnement physiologique. Ces fonctions sont principalement assurées par les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) qui tapissent les microvaisseaux sanguins cérébraux. Ces BMEC expriment une variété de protéines à leur surface, essentielles à l'établissement du phénotype de barrière sélective propre à la BHE. Les propriétés uniques des BMEC proviennent de l'expression de protéines situées sur leur membrane plasmique, qui participent au transport d'influx et/ou d'efflux de composés endogènes et exogènes, ainsi qu'à la formation de jonctions serrées entre elles. Les protéines associées à ces mécanismes de transport sont classées en trois grandes familles. Les transporteurs SLC constituent une large famille de protéines membranaires qui permettent aux composés endogènes et exogènes de traverser les BMEC de manière unidirectionnelle ou bidirectionnelle. Les transporteurs de la famille ABC sont dédiés uniquement à l'efflux de composés afin de protéger le SNC. Enfin, la dernière catégorie concerne les récepteurs impliqués dans la transcytose. De plus, une caractéristique distinctive des BMEC est l'expression, sur leur membrane plasmique, de protéines formant des jonctions serrées, limitant ainsi le passage paracellulaire des molécules. L'étude approfondie de ces protéines, essentielles au fonctionnement de la BHE, est cruciale, que ce soit dans des contextes physiologiques, pathologiques ou expérimentaux. La BHE est une structure où les transporteurs ne sont pas uniquement exprimés à la surface des BMEC et où les protéines membranaires ne représentent qu'une fraction minime du protéome total de la BHE et des BMEC. En ciblant les protéines de la membrane plasmique des cellules endothéliales pour leur enrichissement, on se concentre directement sur les protéines pertinentes de cette population cellulaire. Cet enrichissement facilite également l'identification des protéines par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Il permet même de détecter des protéines qui autrement seraient indétectables dans des échantillons non enrichis, étant masquées par le bruit de fond inhérent aux analyses LC-MS/MS. Nous avons ainsi développé une méthode innovante en microfluidique pour enrichir les protéines de la membrane plasmique après leur biotinylation. Basée sur l'affinité entre la biotine et la streptavidine ou la NeutrAvidin, elle permet d'identifier des transporteurs et des protéines de jonctions, qui sans cet enrichissement resteraient non détectables par LC-MS/MS. Ces expériences ont été menées in vitro sur des cultures de cellules modèles de BMECs humaines, nommées hCMEC/D3, et in vivo par l'injection de sulfo-NHS-SS-biotine via une méthode transcardiaque chez des rats. Les analyses protéomiques par LC-MS/MS s'appuient sur la conversion des protéines en peptides, généralement grâce à des enzymes de digestion telle que la trypsine. Afin de valider notre approche microfluidique pour l'enrichissement protéique en vue de leur analyse par LC-MS/MS, une étude du protocole de digestion SP3 a été entreprise pour optimiser la solubilisation des protéines membranaires et leur digestion. Cette recherche nous a aussi permis de comparer les performances de deux équipements LC-MS/MS dotés de technologies différentes. Nous avons ainsi confronté les capacités d'une machine de type quadripôle couplée à un TOF à celles d'un quadripôle associé à un orbitrap. Les résultats biologiques obtenus ont également participé à une étude démontrant que le jeûne augmente la régulation du transporteur de monocarboxylate Mct1 au niveau de la BHE du rat via l'activation de Ppar delta.