Biochimie, Bactérie, Protéines membranaires, Pompe d'efflux, ABC transporteur, Structure-fonction, Résistance antibiotiques, Sidérophore

Chez les bactéries à Gram négatif, une double membrane lipidique fait partie d'une barrière complexe qui protège contre les menaces extracellulaires. Cette double membrane représente également un défi biologique pour le transport de molécules hors de la bactérie. Les pompes d'efflux tripartites sont des nanomachines bactériennes qui traversent les deux membranes et elles s'organisent autour d'un transporteur de la membrane interne, avec une protéine adaptatrice périplasmique reliant le transporteur à une porine de la membrane externe. MacB et PvdT sont des transporteurs d'intérêt appartenant au type VII de la superfamille des transporteurs ATP-Binding Cassette (ABC) et forment les pompes d'efflux tripartites homologues MacAB TolC chez Escherichia coli et PvdRT OpmQ chez Pseudomonas aeruginosa. MacAB TolC joue un rôle significatif dans la survie et la pathogénicité d'E. coli en sécrétant une toxine : l'entérotoxine de type II thermostable ainsi que des molécules de protoporphyrine IX. Un deuxième rôle de reconnaissance et d'efflux de certains macrolides a été démontré lorsque la bactérie ne possède pas la pompe d'efflux AcrAB, cruciale pour l'efflux d'antibiotiques. PvdRT OpmQ permet à P. aeruginosa de sécréter la pyoverdine (PVD), un sidérophore impliqué dans la capture du fer dans l'environnement extracellulaire. Bien que les rôles fonctionnels de ces protéines soient assez bien compris, les aspects mécanistiques du transport ne sont toujours pas très bien compris pour les transporteurs ABC de type VII. Une combinaison d'expériences fonctionnelles et structurales permet de suggérer des modèles de cycles catalytiques qui décrivent leur fonctionnement probable. Durant ma thèse, j'ai contribué à une première étude sur MacAB TolC reconstituée dans des environnements lipidiques permettant la mesure des deux fonctions de ce complexe : l'hydrolyse de l'ATP et l'activité de transport du substrat. J'observe que ces deux évènements sont concomitants dans le temps et je propose ainsi un rôle de l'hydrolyse de l'ATP dans l'efflux de substrat par MacAB TolC. Ces résultats permettent une discussion plus approfondie sur le cycle catalytique de cette pompe et ses événements critiques. J'ai également mené une deuxième étude sur MacAB TolC qui s'intéresse aux effets allostériques sur l'activité d'hydrolyse de l'ATP de MacB. J'ai confirmé dans un premier temps ce que nous apporte la littérature : MacA augmente l'activité ATPasique de MacB. Et dans un second temps, je montre que TolC augmente encore plus l'activité de MacB en présence de MacA. La reconstitution des protéines dans des environnements lipidiques augmente l'activité de MacB en présence de MacA ou de MacA et TolC. Le macrolide érythromycine, substrat de la pompe, augmente également l'activité de MacB dans différentes conditions. Ces résultats nous permettent de réexaminer les données structurales disponibles dans la littérature. Enfin, j'ai mis au point la production des trois composants de la pompe d'efflux tripartite PvdRT OpmQ ce qui permet leur étude fonctionnelle et structurale. Je montre que PvdT est une protéine active dans des micelles de détergent et la présence de PVD ou de lipides a un effet activateur dans la capacité de PvdT à hydrolyser l'ATP. J'ai également obtenu des résultats structuraux préliminaires de PvdRT avec un modèle in silico construit par collaboration et combiné à des résultats de microscopie à coloration négative. Cela ouvre des perspectives de recherche pour sa future étude structurale en utilisant la cryo-microscopie électronique à particule unique.