Histone méthyltransférase, SETD2, ACK1, Cancer, Triméthylation H3K36, Substrat non histone, Mutations oncogéniques

L'histone méthyltransférase SETD2 est responsable de la triméthylation de la lysine 36 sur l'histone H3. Cette marque épigénétique (H3K36me3) est notamment cruciale pour la régulation de la transcription, l'épissage et la réparation de l'ADN. De nombreuses études ont montré que SETD2 est un suppresseur de tumeur fréquemment muté dans le cancer. Cependant, à ce jour, aucune étude n'a clairement étudié l'impact structurel et fonctionnel de ces mutations récurrentes de SETD2 associées au cancer. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la mutation non caractérisée S1624C de SETD2 qui a été rapportée notamment chez plusieurs patients atteints de lymphome à cellules T. Il est intéressant de noter qu'elle est située dans le domaine catalytique de SETD2 et qu'elle pourrait donc affecter ses propriétés enzymatiques. Les résidus Cys peuvent en effet conférer des propriétés redox et peuvent perturber la structure de l'enzyme en s'engageant dans des liaisons disulfures. La structure du domaine catalytique de SETD2 repose en outre sur deux doigts de zinc impliquant 11 cystéines. L'objectif de ce premier projet était donc de caractériser l'impact structural et fonctionnel de cette mutation sur SETD2. Les tests de méthylation (HPLC, western blot/radioactivité) ont montré que l'activité de la lysine méthyltransférase du mutant SETD2 S1624C est drastiquement réduite par rapport à la forme sauvage. Une forte diminution d'H3K36me3 est également observée sur les histones extraites de cellules transfectées avec le mutant. D'autre part, l'analyse de la structure cristallographique du mutant S1624C en complexe avec le cofacteur SAM (S-adénosylméthionine) et un peptide de l'histone H3 a montré que la mutation n'altère pas la liaison du cofacteur. En revanche, la mutation génère par encombrements stériques de légères déformations locales qui semblent avoir un impact sur la liaison du peptide. D'autres résultats ont indiqué que le remplacement de cette Ser par une Cys, réduit également la stabilité du mutant et provoque une libération accrue des atomes de zinc provenant des doigts de zinc du site actif de l'enzyme. La formation d'agrégats réversibles dépendant du disulfure est également accrue pour le mutant S1624C, ce qui confirme que la mutation augmenterait la sensibilité redox de la forme mutante par rapport à SETD2 WT. Cette étude fournit donc les bases moléculaires de l'altération de l'activité de la lysine méthyltransférase du mutant oncogène SETD2 S1624C. Outre la triméthylation de H3K36, des études récentes indiquent que SETD2 pourrait également être impliqué dans d'autres processus cellulaires clés par le biais de la méthylation de protéines non histones. En méthylant l'alpha-tubuline sur K40, il a par exemple été démontré que SETD2 a un impact sur l'organisation des microtubules. Compte tenu de l'intérêt croissant pour l'identification et la caractérisation des substrats non-histones de SETD2, nous avons effectué des approches in silico pour identifier les substrats putatifs de SETD2 dans le protéome humain. Le résidu K514 de la tyrosine kinase d'ACK1 se trouve sur un motif similaire au motif de séquence H3K36. ACK1 est impliquée dans différentes voies de signalisation et semble être activée de manière récurrente dans les cellules cancéreuses. Ce second projet apporte des preuves moléculaires et structurales in vitro de la tyrosine kinase ACK1 en tant que substrat putatif non histone de SETD2. Nous avons découvert que la lysine 514 d'ACK1 pouvait être méthylée (mono, di et tri-méthylée) par SETD2 en utilisant des peptides dérivés d'ACK1 (essais UFLC et spectrométrie de masse) et des domaines recombinants d'ACK1 comprenant la lysine K514 (dosages radioactifs et Western Blot). En outre, nous avons également obtenu une structure du domaine catalytique de SETD2 en complexe avec un peptide dérivé du motif ACK1 méthylé à 1,8 Å, ce qui confirme que SETD2 peut effectivement méthyler K514 in vitro.