Inflammasome NLRP3, PCNA, Regulator, NEK7, Macrophage, Inflammation

PCNA est une protéine nucléaire essentielle à la réplication de l'ADN. Dans le neutrophile, cellule différenciée qui ne prolifère pas, PCNA est exclusivement cytosolique et agit comme une protéine d'échafaudage qui exerce diverses fonctions régulatrices dépendantes de ses protéines partenaires. En particulier, PCNA est anti-apoptotique en interagissant avec les procaspases-3/8/9/10. Le peptide p21 et le T2AA sont deux composés dissociant ces interactions en se fixant à PCNA. Ils sont pro-apoptotiques et anti-inflammatoires dans différents modèles, faisant de PCNA une cible dans les maladies inflammatoires. L'inflammasome NLRP3 est un complexe multiprotéique composé de NLRP3, ASC et procaspase-1. Activé en réponse à des signaux de stress et de danger, il conduit à l'activation de la caspase-1, à la sécrétion de cytokines inflammatoires comme l'IL-1B et à une mort inflammatoire par pyroptose. D'autres protéines participent à l'activation de l'inflammasome telles que la procaspase-8 et NEK7 (NIMA (Never In Mitosis A)-related Kinase 7). PCNA étant capable de former un complexe moléculaire régulant l'activité des caspases, et les procaspases-1 et 8 faisant partie de l'inflammasome NLRP3, j'ai émis l'hypothèse que PCNA pourrait servir de plateforme de régulation de l'inflammasome NLRP3 via son interaction avec des caspases. En utilisant un modèle d'étude in vitro, la lignée myélomonocytaire humaine THP-1, j'ai d'abord montré que la différenciation des cellules THP-1 en macrophages par la PMA induisait une relocalisation principalement cytoplasmique de PCNA, faisant de ces cellules un bon modèle d'étude de la régulation de l'inflammasome NLRP3 par PCNA. Puis j'ai montré que la stimulation des cellules THP-1 macrophagiques par la toxine bactérienne nigéricine induisait la sécrétion d'IL-1B, et que l'inhibition de PCNA par le peptide p21 entraînait une forte inhibition de cette sécrétion. J'ai confirmé cette diminution de l'activation de la voie canonique de l'inflammasome NLRP3 par p21 en montrant une inhibition à la fois du clivage de la procaspase-1 et de la gasdermine D (GSDMD) activant la pyroptose. En revanche, cette inhibition n'était pas observée dans les cellules THP-1 monocytaires dans lesquelles PCNA est principalement nucléaire. De plus, lors de l'activation de l'inflammasome par des cristaux de monosodium urate, le T2AA inhibait la sécrétion d'IL-1B et le clivage de la procaspase-1 et de la GSDMD. Le p21 et le T2AA inhibaient aussi la sécrétion d'IL-1B après activation de l'inflammasome NLRP3 non canonique par les bactéries E.coli. Enfin, j'ai montré que des macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse de souris invalidées pour p21 sécrétaient plus d'IL-1B en réponse à la nigéricine que ceux de souris sauvages. Afin d'élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents, j'ai regardé si PCNA pouvait être colocalisé avec différents composants de l'inflammasome, de manière basale ou après activation par la nigéricine. J'ai donc montré par immunofluorescence la colocalisation de PCNA avec ASC, caspase-1 et NLRP3 qui est augmentée et plus localisée («speck») après activation de l'inflammasome. J'ai confirmé par test de ligation de proximité la colocalisation de PCNA et ASC. Enfin, j'ai effectué des expériences de co-immunoprécipitation de PCNA dans les cellules THP-1 macrophagiques et j'ai déterminé que NEK7 se liait à PCNA spécifiquement après activation de l'inflammasome par la nigéricine. Il est connu que NEK7 est recrutée sur le complexe inflammasome en se liant directement à la protéine NLRP3, et qu'elle contrôle son oligomérisation et celle de ASC. La liaison de NEK7 à PCNA, protéine d'échafaudage moléculaire, pourrait donc être un évènement essentiel à l'activation de l'inflammasome NLRP3. Ainsi, mes travaux ont permis de mettre en lumière comment le PCNA cytoplasmique peut réguler l'inflammation dans les macrophages. Ils devraient ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le domaine des maladies inflammatoires.