Activité, Amphipol, Cryo-Microscopie électronique, Détergent, Film aqueux mince, Interface air/eau, Lipides, Protéine membranaire, Solubilisation, Tensioactif, Tension de surface

Le travail de thèse présenté ici suit deux axes de recherche avec, comme fil rouge, une famille de polymères amphiphiles, les amphipols, conçus pour l'étude des protéines membranaires. L'obtention de structures tri-dimensionnelles (3D) fines des protéines est essentielle dans le processus de compréhension de leur fonctionnement, et l'identification d'éventuels sites d'intérêts, tels que des sites de liaison de substrats. Jusqu'en 2013, de telles structures étaient principalement obtenues par cristallographie des rayons X. L'essor de la microscopie électronique en tant qu'alternative a progressivement donné accès à des reconstructions 3D de grande précision (structures de quelques Å de résolution) à partir d'images bi-dimensionnelles (2D) de particules isolées, maintenues dans un environnement aqueux vitrifié par cryogénie (cryo-microscopie électronique, cryo-EM). La technique est toutefois venue avec son lot de difficultés à surmonter, notamment en ce qui concerne l'obtention de bonnes conditions d'imagerie (homogénéité de la glace, orientation aléatoire des particules, ...). C'est ici que l'amphipol A8-35 fait son entrée, son ajout empirique dans plusieurs études indépendantes ayant conduit à une amélioration significative des caractéristiques des échantillons observés. Le premier objectif du travail effectué a été d'investiguer le rôle de l'A8-35 et celui d'un détergent très utilisé, le dodécylmaltoside (DDM), sur la préparation d'échantillons de cryo-EM. A cet effet, les propriétés physico-chimiques de solutions aqueuses contenant l'A8-35 et le DDM (stabilité de films minces, tension de surface, propriétés de mouillage) ont été comparées aux caractéristiques d'échantillons de cryo-EM (stabilité de films, distribution d'épaisseur de glace) préparés à concentrations variables pour chacun des tensioactifs. Les résultats obtenus, mettant notamment en évidence un gain de qualité et de reproductibilité des grilles préparées avec des solutions d'A8-35 dépassant une concentration seuil, ont ensuite été mis à profit pour améliorer l'étude structurale d'une protéine membranaire modèle, le récepteur m5-HT3A de souris, maintenu en solution en présence d'A8-35. A l'origine de son développement, l'amphipol A8-35 avait été proposé comme alternative aux détergents, ces derniers étant classiquement employés pour extraire les protéines de l'environnement membranaire et les maintenir en solution aqueuse en empêchant leur agrégation due à leur domaine transmembranaire hydrophobe. Toutefois, les détergents se montrent parfois « agressifs » vis-à-vis des protéines membranaires, induisant leur dénaturation partielle, voir leur dissociation. Les velléités de s'affranchir de cet inconvénient ont conduit au développement de tensioactifs moins invasifs (amphipols, SMA, ...), ainsi qu'à l'échafaudage d'assemblages supramoléculaires (nanodisques, liposomes, ...). L'A8-35, bien qu'encore extensivement utilisé, s'est vu progressivement relégué au second plan en raison de la variabilité de ses propriétés d'extraction des protéines de l'environnement membranaire en fonction du système d'étude. Cette limitation a été levée grâce au développement de polymères dérivés de l'A8-35 porteurs de groupes hydrocarbonés cycliques, les CyclAPols. Le second objectif du travail réalisé a été de poursuivre la synthèse et la caractérisation d'une banque de CyclAPols. A cet effet, ils ont été testés sur deux protéines membranaires modèles : la bactériorhodopsine, présente dans la membrane pourpre, et le transporteur BmrA, exprimé dans la membrane plasmique d'E.coli. Ils ont notamment été comparés de manière prometteuse aux actuels polymères de référence, les SMAs, tant sur le plan de l'efficacité d'extraction des protéines membranaires avec préservation d'un environnement lipidique natif, que sur le plan de la stabilité des protéines et de la conservation de l'activité protéique, tout en mettant en évidence une variabilité des propriétés en fonction du système étudié.