RCPG, Orexines, Récepteurs aux orexines, Protéine Gq, Voies de signalisation, Mobilisation du calcium intracellulaire, Apoptose mitochondriale, Cancers digestifs

Les récepteurs de type 1 aux orexines (OX1R) sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) activés par deux neuropeptides hypothalamiques, les orexines A et B (OxA et OxB). Ils sont impliqués au niveau du système nerveux central entre autres, dans la régulation du sommeil. Mon équipe a montré qu'OX1R est une cible thérapeutique potentielle dans les cancers digestifs. En effet, il est exprimé de façon ectopique notamment dans les adénocarcinomes coliques et pancréatiques. Dans les cellules cancéreuses, l'activation d'OX1R par les orexines conduit à deux voies de signalisation intracellulaires : la voie canonique calcique qui passe par le recrutement de la phospholipase C (PLC) et une voie passant par la tyrosine kinase SRC et la tyrosine phosphatase SHP2 conduisant à une apoptose mitochondriale des cellules. Des antagonistes de la voie calcique, comme l'almorexant ou le lemborexant ont été développés par des groupes pharmaceutiques pour traiter l'insomnie. Or de façon surprenante, l'almorexant comme le lemborexant sont capables d'activer la voie apoptotique dans ces cellules cancéreuses. Par ailleurs, il est connu que la régulation de l'activité/expression des RCPG passe par deux mécanismes nommés la désensibilisation et l'internalisation. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été de comprendre comment des ligands aux propriétés différentes peuvent discriminer ces deux voies de signalisation cellulaire en nous intéressant à l'internalisation du récepteur après activation par les deux types de ligands. Dans un premier temps, pour faciliter l'étude de l'internalisation d'OX1R, j'ai développé l'utilisation de la cytométrie en flux et en images, sur des modèles de cellules cancéreuses coliques qui sont des cellules épithéliales adhérentes. J'ai montré que l'internalisation d'OX1R peut être étudiée par cette approche sur des lignées cancéreuses coliques cultivées en 2D ou en 3D grâce à une OxA rendue fluorescente par couplage à la rhodamine. J'ai ensuite montré que le récepteur OX1R est colocalisé avec les endosomes précoces dès 15 min de traitement par l'OxA et qu'une partie des récepteurs est dégradée dans les lysosomes et une partie est recyclée à la membrane plasmique. En revanche, aucune internalisation d'OX1R n'a été observée après activation par l'almorexant ou le lemborexant. Cette internalisation d'OX1R implique la protéine beta-arrestine 2, mais ni la beta-arrestine 1, ni la beta-arrestine 2 n'ont de rôle dans l'induction de la voie apoptotique induite par l'OxA. De plus, j'ai démontré que seule la protéine Gq est cruciale pour l'internalisation du récepteur et pour l'induction des deux voies de signalisation par ses ligands, aucune autre protéine G n'étant recrutée après activation d'OX1R par l'OxA ou les antagonistes dans les cellules étudiées. Cependant, l'almorexant ou le lemborexant induisent bien le recrutement de la protéine Gq. Néanmoins, grâce à des techniques de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Tranfert) et de simulation de dynamique moléculaire, la protéine Gq, composée de trois sous-unités (la sous-unité alpha q et le dimère beta/gamma), semble dans ces conditions, ne pas se dissocier complètement, mais présenterait des réarrangements structuraux permettant le recrutement au niveau d'OX1R des protéines impliquées dans le déclenchement de l'apoptose des cellules comme SRC et SHP2. Ces résultats démontrent clairement comment un antagoniste d'un RCPG peut être un «antagoniste partiel» permettant le déclenchement d'une des deux voies de signalisation normalement induites par l'activation du récepteur. Ces travaux apportent également un nouvel éclairage sur les mécanismes d'activation des voies de signalisation induites par OX1R permettant d'envisager le développement de molécules à visée thérapeutique ciblant ce récepteur dans les cancers digestifs.