| Resumé |
Les entérobactéries sont capables d'utiliser des acides gras (AG) exogènes comme sources uniques de carbone et d'énergie. Après leur import dans la cellule, les AG sont les substrats des enzymes de dégradation des AG (Fad) du cycle de B-beta;-oxydation. Chez E. coli, en plus de la machinerie FadDEBA canonique, un deuxième groupe d'enzymes FadIJK a été proposé pour fonctionner spécifiquement en anaérobiose. Caractériser une telle B-oxydation en anaérobiose est important pour la compréhension du métabolisme des entérobactéries dans l'intestin. Cependant, depuis les premières observations en 2003, aucune autre étude n'a été menée. Le premier objectif de la thèse était de caractériser le deuxième système Fad et d'identifier les composants manquants. Les gènes ydiO et ydiQRST ont été proposés pour coder respectivement une déshydrogénase anaérobie et une chaîne de transfert d'électrons reliant le cycle de B-oxydation à la chaîne respiratoire. Cependant, nous n'avons pu mettre en évidence aucun phénotype dans la dégradation des AG qui seraient causés par la délétion de ces gènes. De plus, la surproduction de YdiO n'a pas restauré la croissance d'un mutant fadE sur AG +/-O2, et l'acyl-CoA synthase putative anaerobique FadK n'a pas non plus complémenté un mutant fadD. Nous avons ensuite étudié l'implication des facteurs transcriptionnels répondant à la présence d'oxygène ou de la source de carbone disponible. Nous avons montré que l'expression de fadIJ est régulée exactement comme celle des gènes fadDEBA, et surtout que fadIJK ne sont pas induits en -O2. Tous nos résultats montrent donc que les enzymes FadKIJ ne sont pas spécifiques pour la dégradation des AG en -O2, et que YdiO et YdiQRST ne sont pas impliqués dans ce métabolisme. Cependant, nous avons confirmé que FadIJ jouaient un rôle accessoire dans le métabolisme des AG, qui reste à être compris. Un deuxième aspect de la thèse était d'étudier l'enzyme auxiliaire FadH, essentielle pour dégrader les AG poly-insaturés tels que le linoléate. Puisque FadH contient un cluster Fe-S, nous avons supposé que la dégradation des AG dépendant de FadH pourrait être sensible à la carence en fer. En effet, la croissance de la souche sauvage d'E. coli en carence en fer est altérée spécifiquement sur linoléate. De plus, des enzymes eucaryotes effectuant la même réaction que FadH, mais dépourvues du cluster Fe-S, peuvent sauver la croissance de E. coli sur linoléate en carence en fer. Ces résultats ont été complétés par une approche de mutagenèse pour étudier le rôle du cluster Fe-S dans la fonction de FadH et le mécanisme de complémentation par les enzymes eucaryotes. La troisième partie de la thèse concerne la caractérisation du régulateur transcriptionnel YdiP et de son régulon. Le gène ydiP se trouve dans un locus de gènes potentiellement impliqués dans différents aspects du métabolisme carboné : la conversion du shikimate en chorismate, pour la synthèse d'acides aminés aromatiques et de quinones (ydiLMNB-aroD), et une voie alternative potentielle de dégradation des AG (ydiFOP-ydiQRSTfadK). Une analyse transcriptomique a permis de montrer que les gènes ydiLMNBaroD et ydiFO, situés en amont de YdiP, sont fortement induits lors de la surproduction de YdiP. Les données transcriptomiques ont été confirmées aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. Tous ces gènes sont transcrits en opéron à partir d'un promoteur unique situé devant ydiL, et activé par YdiP. De plus, par une stratégie de recherche de mutations suppresseurs, nous avons montré que le locus est réprimé par H-NS, suggérant un mécanisme d'anti-silencing de H-NS par YdiP. En parallèle, la caractérisation de la protéine YdiP a permis d'identifier les résidus cruciaux pour sa fonction. De façon intéressante, le régulon de YdiP présente de nombreuses ressemblances avec celui de dégradation de la carnitine, ce qui suggère un rôle du régulon YdiP dans une voie catabolique spécifique mais du même type. |