Complexes de pores nucléaires, Complexe-Y, MESCs, Différenciation, Régulation des gènes, Nup43, Nup133

Les complexes de pores nucléaires (NPCs) sont ancrés dans l'envelope nucléaire et permettent le transport nucléocytoplasmique. Ces assemblages macromoléculaires de ~30 protéines différentes appelées nucléoporines (Nups), sont aussi des acteurs clés de la régulation des gènes, de la différenciation cellulaire et du développement. Pendant ma thèse, je me suis intéressée aux Nups du Y-complexe (Y), les unités structurelles composant les anneaux nucléaire et cytoplasmique des NPC, et leurs rôles dans la différenciation neuronale (DN). Des mutations de Nups du Y sont à l'origine de troubles neurodéveloppementaux, parfois associés à une déficience rénale précoce. Chez la souris, l'absence de la protéine du Y Nup133 entraîne un retard de croissance, une altération de la DN et une létalité embryonnaire. Notre équipe a de plus montré que les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs) Nup133-/-, présentent un défaut dans l'assemblage du panier nucléaire des NPC et une forte mortalité cellulaire lors de la DN. De même, l'inactivation de Seh1, qui entraîne une légère réduction de la densité des NPCs dans les mESCs, altère la viabilité des mESCs lors de la DN. J'ai donc exploré la contribution des protéines du Y dans l'assemblage des NPC, la division cellulaire et la différenciation dans le système modèle des mESCs. Seh1 fait partie du bras court du Y, mais on la trouve aussi dans le complexe GATOR2, permettant la détection de nutriments. Pour démêler la contribution de chacun des complexes, j'ai généré et caractérisé une lignée de mESCs KO pour Nup43, autre Nup du bras court. Nous avons constaté que, comme dans les cellules Seh1-/-, elles présentent une réduction de la densité des NPC, et la croissance à l'état pluripotent ainsi que la DN sont altérées, suggérant qu'altérer le bras court du Y suffit à provoquer ces phénotypes. J'ai ensuite voulu caractériser le rôle de Nup133. J'ai d'abord cherché à savoir si Nup133 est déjà nécessaire pour sortir de la pluripotence naïve, ou seulement plus tard, pour l'engagement des cellules dans un lignage cellulaire. Pour cela, j'ai induit la transition de mESCs naïves en EpiLCs amorcées (état de pluripotence tardive dans lequel les cellules commencent à exprimer des marqueurs de lignage) de cellules Nup133-/-. La survie des EpiLCs n'est pas affectée par l'absence de Nup133, indiquant qu'elle n'est pas nécessaire pour amorcer la compétence à la spécification de lignage. De plus, l'activation de la voie WNT ou BMP, induit rapidement les gènes cibles dans les EpiLCs contrôles et Nup133-/-, suggérant que le transport nucléocytoplasmique en aval de ces voies de signalisation n'est pas affecté en absence de Nup133. J'ai ensuite étudié le rôle de Nup133 au début de la DN. Notre analyse RNA-seq avait précédemment permis d'identifier des gènes dérégulés dans les cellules Nup133-/- en différenciation. Au vu des rôles des Nups du panier nucléaire dans la régulation des gènes, nous avons étudié les cellules Nup133mid, comprenant une délétion centrale de la protéine, et comme les mESCs Nup133-/-, un défaut d'assemblage du panier. Pour plusieurs des gènes identifiés dans le RNA-seq, dont Nup210L et Lhx1, nous avons mesuré par RT-qPCR des dérégulations similaires dans les deux lignées. J'ai ensuite généré une lignée Nup133-degron, dans laquelle l'ajout d'Auxine permet de dégrader Nup133. J'ai observé une augmentation rapide des niveaux d'ARNm de Nup210L après déplétion de Nup133, alors que la dérégulation de Lhx1 nécessite un traitement plus long. De manière inattendue, bien que ces deux gènes soient correctement exprimés dans les cellules Nup133-degron non traitées, j'ai constaté que l'intégrité du panier y était constitutivement altérée. De plus, nous avons découvert que Nup210L et Lhx1 étaient également dérégulés en absence de Seh1. Ces données indiquent que la régulation de Nup210L et Lhx1 dépend du Y, plutôt que d'un panier nucléaire correctement assemblé ou d'une fonction Nup-spécifique.